Синтез биосовместимых жидкого кристалла эластомерных пен, как Cell Каркасы для 3D-пространственных культур клеток

Целью этой процедуры является получение биоразлагаемых, трехмерных пеноподобных каркасов ячеек на основе биосовместимых жидкокристаллических эластомеров боковой цепи. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области жидких кристаллов и биомедицины, такие как влияние свойств жидкокристаллического эластомера на пролиферацию и выравнивание клеток. Основное преимущество этого метода двумерных клеточных каркасов заключается в том, что он позволяет изучать пространственные межклеточные взаимодействия, что редко возможно в двухмерных макросредах.

Как правило, новички в этом методе испытывают трудности с тестами на тактильную компрессию. Идея этого метода пришла нам в голову после того, как нам пришлось менять фильтрующий материал в сотнях чашек Петри. Мы задались вопросом, могут ли жидкие кристаллические эластомеры поддерживать мышечные клетки в 3D-сети, чтобы исключить использование большого количества чашек Петри.

Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как некоторые этапы требуют осторожных манипуляций с химическими веществами. Кроме того, придание формы шаблону из металлического пенопласта может быть сложной задачей. Сначала наполните ампулу объемом 20 миллилитров 2%-ным по объему раствором ПФОТЕС в толуоле.

Размешайте раствор в ампуле в течение 24 часов, чтобы силанизировать внутреннюю часть ампулы. Силанизированную ампулу промойте изопропиловым спиртом и высушите при температуре 140 градусов Цельсия в течение 30 минут. Поместите в сухую ампулу 3,64 грамма дистиллированного эпсилон-капролактона, 0,5 грамма альфа-хлор-эпсилон-капролактона и 0,25 миллилитра глицерина.

Перемешайте смесь в течение одной минуты. Затем добавьте в смесь 4,90 грамма DL-лактида, и продуйте атмосферу ампулы газообразным азотом в течение одной минуты. Накройте отверстие ампулы алюминиевой фольгой, и нагрейте смесь до 120 градусов Цельсия в течение примерно двух часов, чтобы расплавился DL-лактид.

Перемешайте смесь в вихре, чтобы нарушить любые нерасплавленные твердые вещества, а затем добавьте 66 микролитров 10-2-этилгексаноата в ампулу, и снова перемешайте. Закройте ампулу алюминиевой фольгой и нагрейте смесь до 120 градусов Цельсия в течение 10 минут, чтобы расплавить DL-лактид. Как только DL-лактид снова расплавится, энергично перебейте смесь и продуйте атмосферу ампулы газообразным азотом.

Запечатайте ампулу резиновой перегородкой. Введите иглу, подключенную к вакуумной линии через перегородку, и запустите вакуум. Запечатайте горлышко ампулы пламенем, стараясь не расплавить резиновую пробку.

После того, как горлышко будет запечатано, нагрейте реакционную смесь до 140 градусов Цельсия в течение 48 часов. Затем дайте смеси остыть до комнатной температуры. Вскройте ампулу и растворите вязкую реакционную смесь в 10 миллилитрах дихлорметана.

Переложите смесь в разделительную воронку. Поместите колбу, содержащую 100 миллилитров метанола, в ванну с сухим льдом и ацетоном, чтобы охладить метанол примерно до минус 78 градусов по Цельсию. Как только метанол остынет, закрепите разделительную воронку над колбой.

Добавляйте реакционную смесь к холодному метанолу из расчета две капли каждую секунду. Соберите образовавшийся белый осадок на фильтровальную бумагу. Высушите осадок в вакуумной печи при температуре от 50 до 60 градусов Цельсия, чтобы получить трехплечевый продукт альфа-хлор SBC.

Для приготовления альфа-холестерилового трехплечевого SBC подвесной атом хлора заменяется азидом. Клик-реакция с холестерил5-гексиноатом приводит к образованию кулона холестерила в виде жидкокристаллической части. Чтобы начать приготовление каркаса из жидкокристаллического эластомера, соедините 0,75 грамма альфа-холестеринового трехплечевого SBC с 0,25 миллилитров HDI и 0,24 миллилитров дистиллированного эпсилон-капролактона.

Добавьте к этому 60 микролитров 10-2-этилгексаноата и перемешайте смесь в вихре. Затем вырежьте кусок никелевого поролона размером один на четыре сантиметра. Скатайте никелевую пену в цилиндр диаметром один сантиметр и высотой один сантиметр, чтобы сформировать шаблон для каркаса из пенопласта на основе жидкокристаллического эластомера.

Поместите шаблон в стеклянный флакон или корпус из алюминиевой фольги и полейте шаблон смесью жидкокристаллических эластомеров до полного покрытия. Дайте шаблону постоять в жидкокристаллической эластомерной смеси в течение двух минут, а затем удалите излишки с помощью пипетки. Нагрейте смесь и шаблон при температуре 80 градусов Цельсия на ночь.

Затем снимите алюминиевую фольгу или разбейте стекло. Используйте лезвие бритвы для удаления излишков жидкокристаллического эластомера, чтобы обнажить никелевый металлический шаблон. Поместите пену в колбу и добавьте 70 миллилитров насыщенного водного раствора трех хлоридов железа.

Размешайте пену в растворе в течение трех суток при комнатной температуре, чтобы растворить никелевый шаблон. Каждые 24 часа помешивайте пену в деионизированной воде в течение 30 минут, а затем возобновляйте помешивание в свежем растворе трех хлоридов железа. После второго дня помешивания проведите испытание на тактильное сжатие жидкокристаллической эластомерной пены.

Устойчивость к тактильному сжатию указывает на то, что никелевый шаблон все еще присутствует в пене. По прошествии третьего дня все никелевые шаблоны удаляются, а образовавшаяся пена получается очень мягкой и легко полностью сжимается. Никелевый шаблон должен быть полностью исключен.

Важно тщательно промыть жидкую пену из кристаллического эластомера в хлориде железа до тех пор, пока она не станет мягкой на ощупь при проведении испытания на тактильное сжатие. Каркас из пенопласта на основе жидкокристаллического эластомера теперь готов к характеристике и использованию. Как только пена из жидкокристаллического эластомера станет мягкой, промойте ее 70% этанолом для стерилизации.

Чтобы начать процедуру посева, еще раз промойте каркасы из жидкокристаллического эластомерпенопласта дважды в одном миллилитре 70% этанола для стерилизации поверхностей эластомеров. Затем облучайте леса ультрафиолетовым светом в течение 10 минут. Промойте леса еще одной миллилитровой порцией 70%-ного этанола.

Промойте каркасы одним миллилитром стерильной воды и фосфатно-солевого буфера. Загрузите стерилизованные каркасы из жидкокристаллического эластомера в 24-луночные планшеты для культивирования. Приготовьте и подсчитайте суспензию интересующих клеток в соответствующей среде для роста клеток с пенициллином и стрептомицином.

Клеточную суспензию разбавляют в 1,5 раза по 10 до пятой клетки на 100 микролитров с использованием питательной среды. Нанесите каплю разбавленной суспензии ячеек на верхнюю часть каждого каркаса из жидкокристаллического эластомера. Инкубируйте засеянные скаффолды из жидкокристаллического эластомера при температуре 37 градусов Цельсия в атмосфере 5% CO2 в течение двух часов.

Добавьте в каждый каркас еще по 0,5 миллилитра питательной среды, и продолжайте инкубацию. Каждые 48 часов мойте засеянные леса одним миллилитром PBS и добавляйте свежую среду для роста. Продолжайте инкубацию скаффолдов до тех пор, пока клетки не будут готовы к микроскопии.

Эти метические ЛК позволяют изучать сложные тканевые конструкции, способствуя росту и пролиферации клеток. Чтобы сохранить жизнеспособность клеток, пенопласты должны быть стерилизованы, а чистота культур должна поддерживаться постоянно. Чтобы подготовиться к микроскопии, зафиксируйте клетки на скаффолдах раствором 4%-ного параформальдегида в PBS на 15 минут.

Замочите образцы три раза в трех миллилитрах PBS на пять минут. Поместите один образец каркаса в пробирку Eppendorf. Окрашивайте образец раствором 0,1% DAPI в 500 микролитрах PBS в течение 10 минут.

Замочите образец дважды в одном миллилитре PBS на пять минут. А затем сразу же визуализируйте образец с помощью конфокальной микроскопии. Получение стеков изображений, охватывающих выборку, и анализ данных в программе обработки изображений.

Трехплечевый SBC с жидкокристаллическими фрагментами был отлит на шаблоне из никелевого пенопласта с HDI в качестве сшивающего агента. Никелевый шаблон удаляли травлением с получением пеножидко-кристаллического эластомера. Для контроля процесса травления периодически проводились испытания на деформацию сжатия.

После того, как никель был полностью растворен, испытание на деформацию при сжатии показало уменьшение размера на 70% при сжатии. После снятия сжатия жидкая эластомерная пена последовательно восстанавливала свой первоначальный размер и форму. Такое поведение связано с жидкокристаллическими фрагментами, так как аналогичные эластомерные пены, лишенные холестеринового эпсилон-капролактонного фрагмента, не восстанавливались от сжатия.

СКМ морфологии внутреннего пенопласта показала взаимосвязанную сеть полых поролоновых стоек. Регулярная морфология была приписана структуре никелевой пены, что указывает на то, что размер пор и общую форму можно контролировать, выбирая подходящий металлический шаблон. Пена была засеяна клетками нейробластомы, которые прикреплялись к стенкам сети в течение двух дней.

Через 30 дней после посева конфокальная микроскопия показала, что клетки распространились по сети жидкокристаллических эластомеров и образовали несколько слоев, диспергированных по всей эластомерной пене. Наблюдалось удлинение клеточных ядер, которое коррелировало с выравниванием клеток. После освоения этой техники ее можно выполнить в течение трех-четырех недель при правильном выполнении.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как проектировать и готовить каркасы ячеек из жидкокристаллического эластомера с определенными размерами пор и морфологией. При попытке выполнить эту процедуру важно полностью охарактеризовать каждый продукт и контролировать жизнеспособность и рост клеток. Кроме того, правильная техника окрашивания важна для легкого получения изображений конфокальной микроскопии.

После этой процедуры жидкокристаллические эластомеры также могут подвергаться воздействию внешних раздражителей, таких как стресс или магнитные и электрические поля, чтобы ответить на дополнительные вопросы о том, как анизотропное молекулярное упорядочение жидкокристаллических эластомеров влияет на реакцию клеток. Последствия этого метода применимы к изучению патологических процессов, поскольку он предоставляет платформу для динамического изучения влияния внешних агентов на моделируемую активность заболевания и последующие процессы репарации. Хотя эта смектическая жидкая эластомерная пена может дать представление о межклеточных взаимодействиях, ее также можно использовать с другими материалами, такими как полупроводники или металлические наноструктуры.

После своего развития этот метод проложил путь исследователям в биомедицинских областях к разработке долгосрочных экспериментальных платформ, отражающих живые системы.