Подготовка к зачатию кровеносных сосудов мыши

Описана процедура приготовления препаратов на лицевой стороне сонной артерии и аорты мышей. Такие препараты, при иммунофлуоресцентном окрашивании специфическими антителами, позволяют нам изучать локализацию белков и идентификацию типов клеток во всей сосудистой стенке с помощью конфокальной микроскопии.

Общей целью этой процедуры является подготовка аорты и сонной артерии мыши к иммуноокрашиванию на лицо после перевязки левой сонной артерии. Этот метод позволяет изучать организацию, экспрессию каждого белка и возможное состояние антральных клеток и других сосудистых клеток в методах иммуноокрашивания. Препараты En face позволяют анализировать большие участки кровеносных сосудов для оценки региональных различий в экспрессии различных нормальных и возможных параметров клеток.

Демонстрировать процедуру будет доктор Кваико, микрохирург из нашей группы. Начните с того, что поместите мышь под наркозом на хирургическую доску в положении лежа на спине. После подтверждения отсутствия реакции на защемление пальца ноги прикрепите передние лапы к доске в вытянутом положении наружу, а обе задние лапы к правой стороне мыши выставить на левую сторону шеи.

Удалите волосы вокруг шейной области и продезинфицируйте открытые участки кожи. Накройте мышь стерилизованной хирургической простыней с отверстием над операционной областью и нанесите мазь на глаза животного. Переместите мышь под препарирующий микроскоп и сделайте вентральный разрез по средней линии вокруг шейного отдела.

Переместите слюнные железы, покрывающие кровеносные сосуды, на левую сторону животного, чтобы обнажить левую общую сонную артерию, которая разветвляется на левую внутреннюю сонную артерию и левую внешнюю сонную артерию. Аккуратно удалите соединительную ткань вокруг и ниже левой внутренней сонной артерии и с помощью щипцов проведите 2,5 сантиметра предварительно разрезанного шелкового шовного материала длиной шесть О под артерию, используя второй щипц, чтобы натянуть шов примерно на одну треть его длины на другую сторону сосуда. Перевязать левую внутреннюю сонную артерию.

Затем удалите соединительную ткань вокруг левой наружной сонной артерии, как показано выше, и сделайте лигирование проксимальнее левой верхней щитовидной артерии. Когда все артерии, кроме затылочной артерии, будут перевязаны, верните слюнные железы в исходное положение и увлажните операционное поле двумя-тремя каплями физиологического раствора. Затем используйте шесть швов с O покрытием из викрила, чтобы закрыть кожу и поместите мышь в предварительно нагретую клетку с контролем до полного лежания.

По окончании эксперимента закрепите мышь в лежачем положении на препарирующей доске и с помощью ножниц радужной оболочки обнажите брюшную полость с разрезом по средней линии. Разрежьте ребра сбоку до грудины, чтобы обнажить грудную полость. Затем прорежьте бедренную артерию и вставьте иглу 26 калибра, прикрепленную к гравитационному раствору, установленному в верхушке левого желудочка, чтобы профукализировать кровеносную систему физиологическим раствором, дополненным гепарином.

Продолжайте настаивать до тех пор, пока солевой раствор, вытекающий из разреза, не станет прозрачным. Затем переключите систему изобилия с физиологического раствора на 4% параформальдегид в PBS. Через пять минут переместите мышь под рассекающий микроскоп и с помощью тупых ножниц и щипцов извлеките аорту, а также левую и правую сонные артерии.

Далее перенесите ткани в чашку Петри PBS и осторожно удалите жировые и соединительные ткани с последующим отделением и продольным расщеплением аорты и сонных артерий, чтобы обнажить эндотелий. Самое важное, о чем следует помнить при изготовлении препаратов для кровеносных сосудов на лице, это то, что эндотелиальные клетки легко повреждаются при грубом обращении. Ни в коем случае не растягивайте сосуды, особенно на этапах сбора урожая и очистки.

Затем переложите каждый сосуд в отдельные лунки 12-луночной пластины, содержащей 0,5 миллилитров проникающего раствора на каждую лунку. Пермеабилизируйте кровеносные сосуды в течение 10 минут с покачиванием при комнатной температуре, после чего следует кратковременное промывание в PBS. Блокируйте любое неспецифическое связывание с помощью 30-минутной инкубации в 10% нормальной сыворотке от того же вида, что и планируемые вторичные антитела в TTBS, с покачиванием при комнатной температуре.

Затем пометьте образцы первичными антителами, представляющими интерес, разведенными в TTBS с 10% нормальной сывороткой в течение ночи с покачиванием при четырех градусах Цельсия. На следующее утро промыть кровеносные сосуды тремя 10-минутными полосканиями в ТТБС с укачиванием при комнатной температуре, с последующей инкубацией в соответствующих вторичных антителах, разведенных в ТТБС и 10% нормальной сыворотке и даппи. Верните образцы на коромысло и крышку для защиты от света.

Через час при комнатной температуре с покачиванием промойте образцы три раза в свежем TTBS, как показано на рисунке, с последующим кратковременным промыванием в PBS и нанесите по одной капле реагента против выцветания на каждый сосуд на отдельные защитные стекла размером 22 на 50 миллиметров. Под микроскопом поместите по одному сосуду в каждую каплю реагента эндотелием вниз и накройте сосуды одним стеклом размером 22 на 75 миллиметров на образец. Поместите предметные стекла на чистую лабораторную салфетку и накройте их двумя кусками лабораторной салфетки и 3,5 килограммами груза, чтобы расплющить сосуды.

Максимум через пять минут снимите груз и сотрите излишки раствора вокруг крышки стекла. Затем нанесите лак для ногтей на четыре угла покровных слипов и поместите слайды в слайд-бокс чехлом стороной вверх. На следующее утро используйте еще лак для ногтей, чтобы полностью запечатать покровные стекла и визуализировать сосуды, как только лак для ногтей высохнет.

Здесь показано типичное иммунофлуоресцентное изображение эндотелия с двойным окрашиванием анти-VE кадгерином и антителами против молекулы адгезии сосудистых клеток и иллюстрирующее одиночный оптический срез аорты мыши, взятый вблизи отверстия межреберной артерии. Обратите внимание на окрашивание зеленым цветом линейного контура в месте соединения эндотелиальных клеток и сильную молекулу антисосудистой адгезии клеток, которая окрашивается в отверстие межреберной артерии, где, как известно, происходит нарушение кровотока. На этих изображениях можно наблюдать окрашивание частично переличенной левой сонной артерии и контрольной нелигированной правой артерии через день после операции, при этом в перевязанном сосуде наблюдается повышенная молекула адгезии антисосудистых клеток.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как проводить частичную перевязку левой сонной артерии и делать препараты en face в кровеносных сосудах мыши. Возьмите это с собой с оптикой к другим мелким животным. Использование препаратов en face в настоящее время ограничено иммунофлуоресцентным окрашиванием, но также может быть использовано с другими методами, например, для изучения целых областей после окрашивания иволгой или для экспериментов ex vivo.