Иммунопреципитация хроматина

Хроматиновая иммунопреципитация, или «ChIP», — это метод, используемый исследователями для оценки белково-ДНК-взаимодействий. Белковые факторы играют важную роль в регуляции генов; Они не только организуют ДНК в хромосомах, но и связываются с определенными последовательностями ДНК, называемыми регуляторными сайтами, чтобы активировать или подавить экспрессию. Во время ЧИП хроматин, который состоит из ДНК и связанных с ней белков, «иммунопреципитируется», что означает, что он выделяется с помощью антител. С помощью этого метода исследователи могут оценить, какие белки связаны с какими последовательностями ДНК.

В этом видео мы рассмотрим модификации хроматина и их роль в эпигенетической регуляции, а также то, как ChIP может анализировать эти модификации. Затем мы опишем обобщенную процедуру для этого метода и, наконец, обсудим, как ученые используют ChIP в исследованиях сегодня.

Давайте начнем с рассмотрения того, что такое модификации хроматина и как их изучать с помощью ChIP.

У эукариот ДНК хранится в ядрах путем «обертывания» белковых комплексов. Эти белки являются гистонами, и каждый гистоновый комплекс, обернутый в ДНК, называется «нуклеосомой». Экспрессия генов регулируется «занятостью нуклеосом», или тем, упакован ли участок ДНК в нуклеосомы. Транскрибируемая ДНК, как правило, располагается в «свободных от нуклеосом» областях, что позволяет белкам связываться с регуляторными сайтами гена и позволяет РНК-полимеразе осуществлять транскрипцию.

Современные данные свидетельствуют о том, что изменения в структуре хроматина, которые регулируют экспрессию генов, опосредованы химическими модификациями, вносимыми в гистоны, обычно в их свободно движущиеся «хвосты». Наиболее распространенными из них являются ацетиловые, метиловые и фосфатные группы, которые добавляются к определенным аминокислотам или удаляются из них, и эти различные модификации гистонов, как наблюдается, связаны с различными уровнями или способами экспрессии генов.

Например, добавление трех метильных групп к остатку 27-го лизина в субъединице гистонов H3 — модификация, называемая H3K27me3 — было связано с сайленсингом генов. В качестве альтернативы, модификация H3K9ac, при которой ацетильная группа добавляется к 9-му остатку лизина на гистоне H3, была связана с активацией гена.

Предполагается, что модификации гистонов играют роль в эпигенетической регуляции экспрессии генов, помечая участки хроматина как «активные» или «молчащие». Одним из механизмов, с помощью которого, как полагают, модификации гистонов оказывают свое воздействие, является рекрутирование факторов транскрипции или ферментов, «ремоделирующих» хроматин, последние из которых физически перемещают позиции нуклеосом.

С помощью ChIP специфические модификации гистонов могут быть нацелены на антитела, которые могут быть «притянуты» вниз вместе с окружающей ДНК. Затем исследователи могут использовать ПЦР, микрочипы или секвенирование для идентификации областей ДНК, связанных с модификациями гистонов, представляющими интерес. Варьируя антитела, используемые во время ChIP, этот метод также может помочь точно определить участки ДНК, связанные факторами транскрипции и другими регуляторными белками.

Теперь, когда вы знаете принципы работы ChIP, давайте рассмотрим обобщенную процедуру для этой техники.

Для начала интересующие клетки собираются и обрабатываются химическими веществами, такими как формальдегид, которые действуют как «сшивающие» реагенты и помогают прикреплять белки к последовательностям ДНК, с которыми они связаны, способствуя образованию ковалентных связей между ними. Необходимо соблюдать осторожность, чтобы не «переусердствовать» с обработкой клеток формальдегидом, так как это может повлиять на способность антител распознавать свои целевые модификации гистонов на более поздних стадиях ChIP. Чтобы остановить процесс сшивания, глицин добавляют в раствор формальдегида, которым обрабатываются клетки. Затем клетки собирают и лизируют для высвобождения хроматина.

Чтобы солюбилизировать хроматин и точно определить участки ДНК, которые связываются с модифицированными гистонами, хроматин механически «разрезается» на более мелкие кусочки с помощью звуковых волн — процесс, называемый ультразвуковой обработкой. Как правило, ученые ставят перед собой цель создать фрагменты хроматина длиной от 200 до 1000 пар оснований. После того, как фрагменты хроматина желаемого размера получены, в раствор добавляют антитело, и смесь инкубируют, чтобы дать антителу время распознать свою целевую модификацию гистонов.

Затем в смесь вводят магнитные шарики, с которыми могут связываться антитела, иммобилизуя антителоассоциированные хроматиновые комплексы. Шарики собираются с помощью магнитных штативов и промываются несколько раз, чтобы смыть любой несвязанный хроматин или антитела.

Чтобы высвободить из них хроматин, шарики помещают в раствор, содержащий моющее средство SDS, а после сбора шариков магнитом задерживают надосадочную жидкость. Затем к этому раствору добавляют фермент К для деградации всех белков, включая гистоны, чтобы можно было выделить ДНК-компонент хроматина. Полученная ДНК затем очищается и анализируется.

Давайте теперь посмотрим, как ученые в настоящее время используют ChIP в своих лабораториях.

Многие исследователи используют ChIP для оценки изменений в модификациях гистонов, вызванных внеклеточными сигналами. Здесь культивируемые клетки человека обрабатывали специфическим цитокином, или сигнальной молекулой, и оценивали изменения в метилировании гистонов. Анализируя ДНК ChIP с помощью ПЦР в реальном времени, исследователи определили, что в ответ на лечение ген, кодирующий транскрипционный фактор IRF1, получил активирующую марку гистона, H3K36me3. Эта модификация позволила как регуляторному белку, так и РНК-полимеразе II ассоциироваться с IRF1, что привело к его транскрипции.

ChIP также может быть использован для получения информации об изменениях в экспрессии генов, которые происходят во время повреждения и регенерации тканей. В этом эксперименте исследователи повредили компонент периферической нервной системы у мышей — седалищный нерв — а затем использовали ChIP для поиска новых взаимодействий ДНК-белков в других структурах периферической нервной системы, таких как ганглии, которые окружают спинной мозг. Ученые пришли к выводу, что после повреждения нерва белок p53, который является регулятором репарации ДНК, стал ассоциироваться с геном, участвующим в регенерации тканей, GAP43.

Наконец, некоторые ученые работают над оптимизацией процедур ChIP, чтобы повысить производительность и эффективность экспериментов. Здесь исследователи смогли «автоматизировать» ChIP, заставив машину выполнять многие шаги протокола. Это позволило исследователям одновременно оценить ДНК, связанную с несколькими различными модификациями гистонов, используя относительно небольшое количество клеток — 10 000 — что дало результаты, аналогичные тем, которые наблюдаются при больших числах клеток или при стандартных, «ручных» методах ChIP.

Вы только что посмотрели видео JoVE об иммунопреципитации хроматина. В этом видео мы обсудили, как ДНК и белки вместе образуют хроматин, а также этапы протокола, называемого ChIP, который можно использовать для идентификации последовательностей ДНК, связанных с определенными состояниями хроматина или белками. Мы также изучили, как исследователи используют и модифицируют ChIP, чтобы лучше понять роль ДНК-белковых взаимодействий во время регуляции генов. Как всегда, спасибо за просмотр!