Иммунопреципитация хроматина
Хроматиновая иммунопреципитация, или «ChIP», — это метод, используемый исследователями для оценки белково-ДНК-взаимодействий. Белковые факторы играют важную роль в регуляции генов; Они не только организуют ДНК в хромосомах, но и связываются с определенными последовательностями ДНК, называемыми регуляторными сайтами, чтобы активировать или подавить экспрессию. Во время ЧИП хроматин, который состоит из ДНК и связанных с ней белков, «иммунопреципитируется», что означает, что он выделяется с помощью антител. С помощью этого метода исследователи могут оценить, какие белки связаны с какими последовательностями ДНК.
В этом видео мы рассмотрим модификации хроматина и их роль в эпигенетической регуляции, а также то, как ChIP может анализировать эти модификации. Затем мы опишем обобщенную процедуру для этого метода и, наконец, обсудим, как ученые используют ChIP в исследованиях сегодня.
Давайте начнем с рассмотрения того, что такое модификации хроматина и как их изучать с помощью ChIP.
У эукариот ДНК хранится в ядрах путем «обертывания» белковых комплексов. Эти белки являются гистонами, и каждый гистоновый комплекс, обернутый в ДНК, называется «нуклеосомой». Экспрессия генов регулируется «занятостью нуклеосом», или тем, упакован ли участок ДНК в нуклеосомы. Транскрибируемая ДНК, как правило, располагается в «свободных от нуклеосом» областях, что позволяет белкам связываться с регуляторными сайтами гена и позволяет РНК-полимеразе осуществлять транскрипцию.
Современные данные свидетельствуют о том, что изменения в структуре хроматина, которые регулируют экспрессию генов, опосредованы химическими модификациями, вносимыми в гистоны, обычно в их свободно движущиеся «хвосты». Наиболее распространенными из них являются ацетиловые, метиловые и фосфатные группы, которые добавляются к определенным аминокислотам или удаляются из них, и эти различные модификации гистонов, как наблюдается, связаны с различными уровнями или способами экспрессии генов.
Например, добавление трех метильных групп к остатку 27-го лизина в субъединице гистонов H3 — модификация, называемая H3K27me3 — было связано с сайленсингом генов. В качестве альтернативы, модификация H3K9ac, при которой ацетильная группа добавляется к 9-му остатку лизина на гистоне H3, была связана с активацией гена.
Предполагается, что модификации гистонов играют роль в эпигенетической регуляции экспрессии генов, помечая участки хроматина как «активные» или «молчащие». Одним из механизмов, с помощью которого, как полагают, модификации гистонов оказывают свое воздействие, является рекрутирование факторов транскрипции или ферментов, «ремоделирующих» хроматин, последние из которых физически перемещают позиции нуклеосом.
С помощью ChIP специфические модификации гистонов могут быть нацелены на антитела, которые могут быть «притянуты» вниз вместе с окружающей ДНК. Затем исследователи могут использовать ПЦР, микрочипы или секвенирование для идентификации областей ДНК, связанных с модификациями гистонов, представляющими интерес. Варьируя антитела, используемые во время ChIP, этот метод также может помочь точно определить участки ДНК, связанные факторами транскрипции и другими регуляторными белками.
Теперь, когда вы знаете принципы работы ChIP, давайте рассмотрим обобщенную процедуру для этой техники.
Для начала интересующие клетки собираются и обрабатываются химическими веществами, такими как формальдегид, которые действуют как «сшивающие» реагенты и помогают прикреплять белки к последовательностям ДНК, с которыми они связаны, способствуя образованию ковалентных связей между ними. Необходимо соблюдать осторожность, чтобы не «переусердствовать» с обработкой клеток формальдегидом, так как это может повлиять на способность антител распознавать свои целевые модификации гистонов на более поздних стадиях ChIP. Чтобы остановить процесс сшивания, глицин добавляют в раствор формальдегида, которым обрабатываются клетки. Затем клетки собирают и лизируют для высвобождения хроматина.
Чтобы солюбилизировать хроматин и точно определить участки ДНК, которые связываются с модифицированными гистонами, хроматин механически «разрезается» на более мелкие кусочки с помощью звуковых волн — процесс, называемый ультразвуковой обработкой. Как правило, ученые ставят перед собой цель создать фрагменты хроматина длиной от 200 до 1000 пар оснований. После того, как фрагменты хроматина желаемого размера получены, в раствор добавляют антитело, и смесь инкубируют, чтобы дать антителу время распознать свою целевую модификацию гистонов.
Затем в смесь вводят магнитные шарики, с которыми могут связываться антитела, иммобилизуя антителоассоциированные хроматиновые комплексы. Шарики собираются с помощью магнитных штативов и промываются несколько раз, чтобы смыть любой несвязанный хроматин или антитела.
Чтобы высвободить из них хроматин, шарики помещают в раствор, содержащий моющее средство SDS, а после сбора шариков магнитом задерживают надосадочную жидкость. Затем к этому раствору добавляют фермент К для деградации всех белков, включая гистоны, чтобы можно было выделить ДНК-компонент хроматина. Полученная ДНК затем очищается и анализируется.
Давайте теперь посмотрим, как ученые в настоящее время используют ChIP в своих лабораториях.
Многие исследователи используют ChIP для оценки изменений в модификациях гистонов, вызванных внеклеточными сигналами. Здесь культивируемые клетки человека обрабатывали специфическим цитокином, или сигнальной молекулой, и оценивали изменения в метилировании гистонов. Анализируя ДНК ChIP с помощью ПЦР в реальном времени, исследователи определили, что в ответ на лечение ген, кодирующий транскрипционный фактор IRF1, получил активирующую марку гистона, H3K36me3. Эта модификация позволила как регуляторному белку, так и РНК-полимеразе II ассоциироваться с IRF1, что привело к его транскрипции.
ChIP также может быть использован для получения информации об изменениях в экспрессии генов, которые происходят во время повреждения и регенерации тканей. В этом эксперименте исследователи повредили компонент периферической нервной системы у мышей — седалищный нерв — а затем использовали ChIP для поиска новых взаимодействий ДНК-белков в других структурах периферической нервной системы, таких как ганглии, которые окружают спинной мозг. Ученые пришли к выводу, что после повреждения нерва белок p53, который является регулятором репарации ДНК, стал ассоциироваться с геном, участвующим в регенерации тканей, GAP43.
Наконец, некоторые ученые работают над оптимизацией процедур ChIP, чтобы повысить производительность и эффективность экспериментов. Здесь исследователи смогли «автоматизировать» ChIP, заставив машину выполнять многие шаги протокола. Это позволило исследователям одновременно оценить ДНК, связанную с несколькими различными модификациями гистонов, используя относительно небольшое количество клеток — 10 000 — что дало результаты, аналогичные тем, которые наблюдаются при больших числах клеток или при стандартных, «ручных» методах ChIP.
Вы только что посмотрели видео JoVE об иммунопреципитации хроматина. В этом видео мы обсудили, как ДНК и белки вместе образуют хроматин, а также этапы протокола, называемого ChIP, который можно использовать для идентификации последовательностей ДНК, связанных с определенными состояниями хроматина или белками. Мы также изучили, как исследователи используют и модифицируют ChIP, чтобы лучше понять роль ДНК-белковых взаимодействий во время регуляции генов. Как всегда, спасибо за просмотр!
Гистоны — это белки, которые помогают организовать ДНК в эукариотических ядрах, выступая в качестве «каркасов», вокруг которых ДНК может быть обернута…
Хроматиновая иммунопреципитация, или «ChIP», — это метод, используемый исследователями для оценки белково-ДНК-взаимодействий. Белковые факторы играют важную роль в регуляции генов; Они не только организуют ДНК в хромосомах, но и связываются с определенными последовательностями ДНК, называемыми регуляторными сайтами, чтобы активировать или подавить экспрессию. Во время ЧИП хроматин, который состоит из ДНК и связанных с ней белков, «иммунопреципитируется», что означает, что он выделяется с помощью антител. С помощью этого метода исследователи могут оценить, какие белки связаны с какими последовательностями ДНК.
В этом видео мы рассмотрим модификации хроматина и их роль в эпигенетической регуляции, а также то, как ChIP может анализировать эти модификации. Затем мы опишем обобщенную процедуру для этого метода и, наконец, обсудим, как ученые используют ChIP в исследованиях сегодня.
Давайте начнем с рассмотрения того, что такое модификации хроматина и как их изучать с помощью ChIP.
У эукариот ДНК хранится в ядрах путем «обертывания» белковых комплексов. Эти белки являются гистонами, и каждый гистоновый комплекс, обернутый в ДНК, называется «нуклеосомой». Экспрессия генов регулируется «занятостью нуклеосом», или тем, упакован ли участок ДНК в нуклеосомы. Транскрибируемая ДНК, как правило, располагается в «свободных от нуклеосом» областях, что позволяет белкам связываться с регуляторными сайтами гена и позволяет РНК-полимеразе осуществлять транскрипцию.
Современные данные свидетельствуют о том, что изменения в структуре хроматина, которые регулируют экспрессию генов, опосредованы химическими модификациями, вносимыми в гистоны, обычно в их свободно движущиеся «хвосты». Наиболее распространенными из них являются ацетиловые, метиловые и фосфатные группы, которые добавляются к определенным аминокислотам или удаляются из них, и эти различные модификации гистонов, как наблюдается, связаны с различными уровнями или способами экспрессии генов.
Например, добавление трех метильных групп к остатку 27-го лизина в субъединице гистонов H3 — модификация, называемая H3K27me3 — было связано с сайленсингом генов. В качестве альтернативы, модификация H3K9ac, при которой ацетильная группа добавляется к 9-му остатку лизина на гистоне H3, была связана с активацией гена.
Предполагается, что модификации гистонов играют роль в эпигенетической регуляции экспрессии генов, помечая участки хроматина как «активные» или «молчащие». Одним из механизмов, с помощью которого, как полагают, модификации гистонов оказывают свое воздействие, является рекрутирование факторов транскрипции или ферментов, «ремоделирующих» хроматин, последние из которых физически перемещают позиции нуклеосом.
С помощью ChIP специфические модификации гистонов могут быть нацелены на антитела, которые могут быть «притянуты» вниз вместе с окружающей ДНК. Затем исследователи могут использовать ПЦР, микрочипы или секвенирование для идентификации областей ДНК, связанных с модификациями гистонов, представляющими интерес. Варьируя антитела, используемые во время ChIP, этот метод также может помочь точно определить участки ДНК, связанные факторами транскрипции и другими регуляторными белками.
Теперь, когда вы знаете принципы работы ChIP, давайте рассмотрим обобщенную процедуру для этой техники.
Для начала интересующие клетки собираются и обрабатываются химическими веществами, такими как формальдегид, которые действуют как «сшивающие» реагенты и помогают прикреплять белки к последовательностям ДНК, с которыми они связаны, способствуя образованию ковалентных связей между ними. Необходимо соблюдать осторожность, чтобы не «переусердствовать» с обработкой клеток формальдегидом, так как это может повлиять на способность антител распознавать свои целевые модификации гистонов на более поздних стадиях ChIP. Чтобы остановить процесс сшивания, глицин добавляют в раствор формальдегида, которым обрабатываются клетки. Затем клетки собирают и лизируют для высвобождения хроматина.
Чтобы солюбилизировать хроматин и точно определить участки ДНК, которые связываются с модифицированными гистонами, хроматин механически «разрезается» на более мелкие кусочки с помощью звуковых волн — процесс, называемый ультразвуковой обработкой. Как правило, ученые ставят перед собой цель создать фрагменты хроматина длиной от 200 до 1000 пар оснований. После того, как фрагменты хроматина желаемого размера получены, в раствор добавляют антитело, и смесь инкубируют, чтобы дать антителу время распознать свою целевую модификацию гистонов.
Затем в смесь вводят магнитные шарики, с которыми могут связываться антитела, иммобилизуя антителоассоциированные хроматиновые комплексы. Шарики собираются с помощью магнитных штативов и промываются несколько раз, чтобы смыть любой несвязанный хроматин или антитела.
Чтобы высвободить из них хроматин, шарики помещают в раствор, содержащий моющее средство SDS, а после сбора шариков магнитом задерживают надосадочную жидкость. Затем к этому раствору добавляют фермент К для деградации всех белков, включая гистоны, чтобы можно было выделить ДНК-компонент хроматина. Полученная ДНК затем очищается и анализируется.
Давайте теперь посмотрим, как ученые в настоящее время используют ChIP в своих лабораториях.
Многие исследователи используют ChIP для оценки изменений в модификациях гистонов, вызванных внеклеточными сигналами. Здесь культивируемые клетки человека обрабатывали специфическим цитокином, или сигнальной молекулой, и оценивали изменения в метилировании гистонов. Анализируя ДНК ChIP с помощью ПЦР в реальном времени, исследователи определили, что в ответ на лечение ген, кодирующий транскрипционный фактор IRF1, получил активирующую марку гистона, H3K36me3. Эта модификация позволила как регуляторному белку, так и РНК-полимеразе II ассоциироваться с IRF1, что привело к его транскрипции.
ChIP также может быть использован для получения информации об изменениях в экспрессии генов, которые происходят во время повреждения и регенерации тканей. В этом эксперименте исследователи повредили компонент периферической нервной системы у мышей — седалищный нерв — а затем использовали ChIP для поиска новых взаимодействий ДНК-белков в других структурах периферической нервной системы, таких как ганглии, которые окружают спинной мозг. Ученые пришли к выводу, что после повреждения нерва белок p53, который является регулятором репарации ДНК, стал ассоциироваться с геном, участвующим в регенерации тканей, GAP43.
Наконец, некоторые ученые работают над оптимизацией процедур ChIP, чтобы повысить производительность и эффективность экспериментов. Здесь исследователи смогли «автоматизировать» ChIP, заставив машину выполнять многие шаги протокола. Это позволило исследователям одновременно оценить ДНК, связанную с несколькими различными модификациями гистонов, используя относительно небольшое количество клеток — 10 000 — что дало результаты, аналогичные тем, которые наблюдаются при больших числах клеток или при стандартных, «ручных» методах ChIP.
Вы только что посмотрели видео JoVE об иммунопреципитации хроматина. В этом видео мы обсудили, как ДНК и белки вместе образуют хроматин, а также этапы протокола, называемого ChIP, который можно использовать для идентификации последовательностей ДНК, связанных с определенными состояниями хроматина или белками. Мы также изучили, как исследователи используют и модифицируют ChIP, чтобы лучше понять роль ДНК-белковых взаимодействий во время регуляции генов. Как всегда, спасибо за просмотр!
Хроматиновая иммунопреципитация, или «ChIP», — это метод, используемый исследователями для оценки белково-ДНК-взаимодействий. Белковые факторы играют важную роль в регуляции генов; Они не только организуют ДНК в хромосомах, но и связываются с определенными последовательностями ДНК, называемыми регуляторными сайтами, чтобы активировать или подавить экспрессию. Во время ЧИП хроматин, который состоит из ДНК и связанных с ней белков, «иммунопреципитируется», что означает, что он выделяется с помощью антител. С помощью этого метода исследователи могут оценить, какие белки связаны с какими последовательностями ДНК.
В этом видео мы рассмотрим модификации хроматина и их роль в эпигенетической регуляции, а также то, как ChIP может анализировать эти модификации. Затем мы опишем обобщенную процедуру для этого метода и, наконец, обсудим, как ученые используют ChIP в исследованиях сегодня.
Давайте начнем с рассмотрения того, что такое модификации хроматина и как их изучать с помощью ChIP.
У эукариот ДНК хранится в ядрах путем «обертывания» белковых комплексов. Эти белки являются гистонами, и каждый гистоновый комплекс, обернутый в ДНК, называется «нуклеосомой». Экспрессия генов регулируется «занятостью нуклеосом», или тем, упакован ли участок ДНК в нуклеосомы. Транскрибируемая ДНК, как правило, располагается в «свободных от нуклеосом» областях, что позволяет белкам связываться с регуляторными сайтами гена и позволяет РНК-полимеразе осуществлять транскрипцию.
Современные данные свидетельствуют о том, что изменения в структуре хроматина, которые регулируют экспрессию генов, опосредованы химическими модификациями, вносимыми в гистоны, обычно в их свободно движущиеся «хвосты». Наиболее распространенными из них являются ацетиловые, метиловые и фосфатные группы, которые добавляются к определенным аминокислотам или удаляются из них, и эти различные модификации гистонов, как наблюдается, связаны с различными уровнями или способами экспрессии генов.
Например, добавление трех метильных групп к остатку 27-го лизина в субъединице гистонов H3 — модификация, называемая H3K27me3 — было связано с сайленсингом генов. В качестве альтернативы, модификация H3K9ac, при которой ацетильная группа добавляется к 9-му остатку лизина на гистоне H3, была связана с активацией гена.
Предполагается, что модификации гистонов играют роль в эпигенетической регуляции экспрессии генов, помечая участки хроматина как «активные» или «молчащие». Одним из механизмов, с помощью которого, как полагают, модификации гистонов оказывают свое воздействие, является рекрутирование факторов транскрипции или ферментов, «ремоделирующих» хроматин, последние из которых физически перемещают позиции нуклеосом.
С помощью ChIP специфические модификации гистонов могут быть нацелены на антитела, которые могут быть «притянуты» вниз вместе с окружающей ДНК. Затем исследователи могут использовать ПЦР, микрочипы или секвенирование для идентификации областей ДНК, связанных с модификациями гистонов, представляющими интерес. Варьируя антитела, используемые во время ChIP, этот метод также может помочь точно определить участки ДНК, связанные факторами транскрипции и другими регуляторными белками.
Теперь, когда вы знаете принципы работы ChIP, давайте рассмотрим обобщенную процедуру для этой техники.
Для начала интересующие клетки собираются и обрабатываются химическими веществами, такими как формальдегид, которые действуют как «сшивающие» реагенты и помогают прикреплять белки к последовательностям ДНК, с которыми они связаны, способствуя образованию ковалентных связей между ними. Необходимо соблюдать осторожность, чтобы не «переусердствовать» с обработкой клеток формальдегидом, так как это может повлиять на способность антител распознавать свои целевые модификации гистонов на более поздних стадиях ChIP. Чтобы остановить процесс сшивания, глицин добавляют в раствор формальдегида, которым обрабатываются клетки. Затем клетки собирают и лизируют для высвобождения хроматина.
Чтобы солюбилизировать хроматин и точно определить участки ДНК, которые связываются с модифицированными гистонами, хроматин механически «разрезается» на более мелкие кусочки с помощью звуковых волн — процесс, называемый ультразвуковой обработкой. Как правило, ученые ставят перед собой цель создать фрагменты хроматина длиной от 200 до 1000 пар оснований. После того, как фрагменты хроматина желаемого размера получены, в раствор добавляют антитело, и смесь инкубируют, чтобы дать антителу время распознать свою целевую модификацию гистонов.
Затем в смесь вводят магнитные шарики, с которыми могут связываться антитела, иммобилизуя антителоассоциированные хроматиновые комплексы. Шарики собираются с помощью магнитных штативов и промываются несколько раз, чтобы смыть любой несвязанный хроматин или антитела.
Чтобы высвободить из них хроматин, шарики помещают в раствор, содержащий моющее средство SDS, а после сбора шариков магнитом задерживают надосадочную жидкость. Затем к этому раствору добавляют фермент К для деградации всех белков, включая гистоны, чтобы можно было выделить ДНК-компонент хроматина. Полученная ДНК затем очищается и анализируется.
Давайте теперь посмотрим, как ученые в настоящее время используют ChIP в своих лабораториях.
Многие исследователи используют ChIP для оценки изменений в модификациях гистонов, вызванных внеклеточными сигналами. Здесь культивируемые клетки человека обрабатывали специфическим цитокином, или сигнальной молекулой, и оценивали изменения в метилировании гистонов. Анализируя ДНК ChIP с помощью ПЦР в реальном времени, исследователи определили, что в ответ на лечение ген, кодирующий транскрипционный фактор IRF1, получил активирующую марку гистона, H3K36me3. Эта модификация позволила как регуляторному белку, так и РНК-полимеразе II ассоциироваться с IRF1, что привело к его транскрипции.
ChIP также может быть использован для получения информации об изменениях в экспрессии генов, которые происходят во время повреждения и регенерации тканей. В этом эксперименте исследователи повредили компонент периферической нервной системы у мышей — седалищный нерв — а затем использовали ChIP для поиска новых взаимодействий ДНК-белков в других структурах периферической нервной системы, таких как ганглии, которые окружают спинной мозг. Ученые пришли к выводу, что после повреждения нерва белок p53, который является регулятором репарации ДНК, стал ассоциироваться с геном, участвующим в регенерации тканей, GAP43.
Наконец, некоторые ученые работают над оптимизацией процедур ChIP, чтобы повысить производительность и эффективность экспериментов. Здесь исследователи смогли «автоматизировать» ChIP, заставив машину выполнять многие шаги протокола. Это позволило исследователям одновременно оценить ДНК, связанную с несколькими различными модификациями гистонов, используя относительно небольшое количество клеток — 10 000 — что дало результаты, аналогичные тем, которые наблюдаются при больших числах клеток или при стандартных, «ручных» методах ChIP.
Вы только что посмотрели видео JoVE об иммунопреципитации хроматина. В этом видео мы обсудили, как ДНК и белки вместе образуют хроматин, а также этапы протокола, называемого ChIP, который можно использовать для идентификации последовательностей ДНК, связанных с определенными состояниями хроматина или белками. Мы также изучили, как исследователи используют и модифицируют ChIP, чтобы лучше понять роль ДНК-белковых взаимодействий во время регуляции генов. Как всегда, спасибо за просмотр!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What are histone modifications and how do they affect gene expression?
Histone modifications are chemical changes—such as acetyl, methyl, or phosphate groups—added to histone proteins that regulate gene expression. H3K27me3 marks genes for silencing, while H3K9ac marks genes for activation. These modifications recruit transcription factors and chromatin remodeling enzymes, controlling whether DNA regions remain active or silent in the cell.
Q2: How does chromatin immunoprecipitation isolate protein-DNA interactions?
ChIP uses antibodies to target specific histone modifications or proteins bound to DNA. Cross-linking reagents like formaldehyde fix proteins to DNA, then chromatin is sheared into fragments. Antibodies bind their targets, magnetic beads capture the antibody-protein-DNA complexes, and after washing and protein degradation, the associated DNA is purified and analyzed.
Q3: What is the purpose of sonication in the ChIP protocol?
Sonication uses sound waves to mechanically shear chromatin into smaller, defined fragments typically 200 to 1000 base pairs long. This step solubilizes chromatin and precisely defines the DNA regions associated with modified histones, enabling accurate antibody targeting and improving the specificity of protein-DNA interaction detection.
Q4: How do researchers analyze ChIP results to identify gene regulatory regions?
After isolating ChIP DNA, researchers employ detection and quantification of nucleic acids by real time PCR, microarrays, or sequencing to identify which DNA regions associate with specific histone modifications or regulatory proteins. Real-time PCR provides quantitative data on gene-specific changes, while sequencing reveals genome-wide binding patterns.
Q5: Why is cross-linking important in chromatin immunoprecipitation?
Cross-linking reagents like formaldehyde create covalent bonds between proteins and DNA, fixing them together before cell lysis. This preserves transient protein-DNA interactions that would otherwise dissociate. However, over-treatment with formaldehyde can impair antibody recognition of target histone modifications, so careful optimization is essential.
Q6: What research applications use ChIP to study gene regulation?
Researchers use ChIP to evaluate histone modification changes triggered by signaling molecules, track DNA-protein interactions during tissue regeneration, and identify novel regulatory mechanisms. For example, ChIP revealed that the p53 protein associates with regeneration genes after nerve injury, and automated ChIP streamlines high-throughput analysis of multiple histone modifications simultaneously.
Q7: How does nucleosome occupancy influence gene expression and chromatin structure?
Transcribed genes typically occupy nucleosome-free regions that allow regulatory proteins and RNA polymerase to access DNA sequences. Histone modifications regulate whether nucleosomes remain tightly packed—silencing genes—or are repositioned by chromatin remodeling enzymes to expose regulatory sites and enable transcription and gene activation.
Главы в этом видео
0:00
Overview
1:07
Chromatin Modifications and ChIP
3:46
Generalized ChIP Procedure
5:51
Applications
7:58
Summary