Обзор генной инженерии
Генная инженерия – процесс целенаправленного изменения ДНК организма – использовалась для создания мощных исследовательских инструментов и моделирован…
Генная инженерия – это целенаправленное изменение ДНК организма. Достижения в этой области позволили ученым создавать генетически модифицированные клетки и организмы для биомедицинских исследований и сельскохозяйственных целей. Тем не менее, применение генетических технологий для использования в качестве терапевтических средств у людей, известное как генная терапия, все еще находится в стадии разработки.
В этом видео мы обсудим некоторые важные открытия в истории генной инженерии, основные вопросы, которые изучаются сегодня, важные инструменты для изменения генома организма и несколько применений этих технологий.
Давайте начнем с обзора истории генной инженерии.
Способность ученых напрямую манипулировать генами зависела от разгадки идентичности генетического материала. В 1928 году Фредерик Гриффит заметил, что введение мышам смеси убитых теплом вирулентных бактерий и живого, но невирулентного штамма приводит к заболеванию, что привело его к гипотезе о «трансформирующем принципе», который передается от мертвых к живым бактериям.
В 1944 году Освальд Эйвери, Колин Маклауд и Маклин Маккарти определили, что ДНК бактерий ответственна за эту трансформацию. Результат был подтвержден в 1952 году, когда Альфред Херши и Марта Чейз использовали радиоактивно меченый бактериофаг, чтобы показать, что именно ДНК вируса, а не белок, передается во время заражения бактериальных клеток.
Также в 1952 году Джошуа Ледерберг выдвинул гипотезу о существовании плазмид — небольших круглых кусочков ДНК, которые могут передаваться между бактериями. Примерно в то же время он также описал трансдукцию, при которой вирусы действуют как векторы для передачи ДНК между клетками.
Начиная примерно с 1970 года, такие исследователи, как Гамильтон Смит, начали открывать некоторые практические «инструменты» генной инженерии, такие как эндонуклеазы рестрикции, которые «разрезают» ДНК в определенных последовательностях. Используя эти инструменты, в 1972 году Пол Берг сгенерировал первую «рекомбинантную» молекулу ДНК, соединив ДНК двух разных вирусов, а параллельно Стэнли Коэн и Герберт Бойер создали первый рекомбинантный организм, поместив ген устойчивости к антибиотикам в плазмиду и превратив эту конструкцию в бактерии E. coli.
В 1973 году Рудольф Яниш создал первый трансгенный многоклеточный организм, мышь, содержащую вирусную ДНК SV40, хотя только в 1981 году несколько других лабораторий создали первых трансгенных мышей, способных передавать вставленные гены своему потомству. В середине 1980-х годов Марио Капекки и Оливер Смитис впервые установили, что гомологичная рекомбинация может быть использована для специфического нацеливания на гены, а в 1989 году использовали этот метод для создания первой нокаутной мыши, у которой ген становится нефункциональным.
Далее давайте рассмотрим некоторые ключевые вопросы генной инженерии.
Одной из неотъемлемых областей исследований является определение наилучшего метода модификации генома организма. Необходимо учитывать ряд факторов, в том числе эффективность процесса модификации, а также необходимость нацеливания модификации на конкретные гены, чтобы свести к минимуму риски непреднамеренных изменений в клеточной ДНК.
Для того чтобы модифицировать геном клетки-хозяина, искусственно собранная последовательность ДНК для осуществления этой модификации, известная как «генетическая конструкция», должна быть успешно доставлена в эту клетку. Исследования в этой области направлены на максимизацию эффективности при ограничении цитотоксичности. На уровне организмов исследователи изучают, как модифицировать векторы, такие как ретровирусные частицы или наночастицы, чтобы улучшить доставку конструктов к целевым клеточным популяциям.
Наконец, существует большой интерес к тому, может ли генная инженерия быть успешно применена в сельском хозяйстве или в терапевтических целях. Эти технологии использовались для создания мощных исследовательских инструментов, таких как мыши с удаленными или «нокаутированными генами», или для внедрения простых, единичных признаков, таких как устойчивость к гербицидам, в сельскохозяйственные культуры. Тем не менее, сложные проблемы, такие как выращивание сельскохозяйственных культур, которые процветают в неблагоприятных условиях, вероятно, потребуют одновременной модификации нескольких путей. Кроме того, разработка генной терапии для лечения генетических заболеваний, требующая безопасной и эффективной доставки генетических конструкций в клетки человека, остается сложной задачей.
Давайте теперь рассмотрим инструменты и технологии генной инженерии, которые используют исследователи.
Классическим методом создания генетических конструкций является клонирование на основе ферментов рестрикции, при котором фрагменты ДНК расщепляются, а затем рекомбинируются в определенном порядке с использованием ДНК-лигазы для создания новой плазмиды. К более новым методам относится рекомбинирование, при котором используется гомологичная рекомбинация для выделения и обмена фрагментами ДНК без необходимости использования сайтов расщепления ферментов рестрикции.
ДНК может быть доставлена в клетки с помощью ряда методов. Трансформация или трансфекция — это процесс попадания голой ДНК в бактериальные или эукариотические клетки соответственно. Двухвалентные катионы, такие как кальций, могут сделать клеточные мембраны более пористыми, что увеличит поглощение экзогенных молекул ДНК. Электропорация использует электрическое поле для выполнения той же задачи, в то время как липидные наночастицы, окружающие ДНК, могут сливаться с клеточной мембраной и высвобождать ее полезную нагрузку. Трансдукция относится к переносу ДНК вирусным вектором, таким как лентивирус.
Внедрение генетических конструкций в многоклеточные организмы требует дополнительных соображений. При наличии нескольких типов клеток целевые векторы, такие как вирусы или наночастицы, увеличивают специфичность доставки клеток. В растениях исследователи кооптировали агробактерии, растительные патогены, способные переносить ДНК в клетки растений, в качестве инструмента доставки генов. «Биолистика» относится к использованию «генной пушки» для доставки покрытых ДНК золотых шариков в клетки.
Наконец, доставленные конструкции ДНК должны вносить постоянные изменения в геном хозяина для достижения долгосрочных эффектов. Это может произойти путем случайной интеграции доставленной конструкции ДНК в ДНК хозяина, которая может быть усилена путем маркировки конструкции сайтами узнавания ферментов ДНК, называемых транспозазами. С другой стороны, такие методы, как нацеливание на гены через гомологичную рекомбинацию, позволяют интегрировать их в конкретные геномные сайты. Последние достижения в методах, известных как редактирование генома, в котором используются специально разработанные нуклеазы для создания двухцепочечных разрывов в определенных локусах, значительно повышают эффективность нацеливания генов.
Теперь давайте посмотрим, как сегодня применяются технологии генной инженерии.
Клеточные функции у эукариот разделены на органеллы, и нацеливание экспрессии трансгенного белка на отдельные компартменты может обеспечить более специфические биологические эффекты. В этом эксперименте исследователи создали репортерную конструкцию, помеченную GFP, используя метод сборки Гибсона, где гомологичные области перекрытия между несколькими продуктами ПЦР позволяют создать полную конструкцию без использования ферментов рестрикции. Для доставки этих конструкций в клетки растений использовалась биолистическая трансфекция, и исследователи смогли продемонстрировать экспрессию GFP, направленную на хлоропласт.
Раковые клетки часто чрезмерно экспрессируют поверхностные рецепторы, на которые исследователи могут воздействовать с помощью генной терапии. Здесь ученые создали модель рака мочевого пузыря человека у мышей. Затем следует местная доставка аденовирусного вектора к клеткам рака мочевого пузыря. Наблюдение за экспрессией люциферазы в раковых клетках указывало на успешную доставку репортерного гена.
Наконец, достигнут прогресс в создании полных биологических путей в организме-мишени. Здесь каждый ген биосинтетического пути антибиотика эритромицина был выделен из бактерии-хозяина, Saccharopolyspora erythraea, с помощью ПЦР и объединен в опероноподобные конструкции, где ряд генов находится под контролем одних и тех же регуляторных элементов для обеспечения оптимальной экспрессии. Затем эти конструкции преобразовывались в E. coli, чтобы воссоздать путь синтеза, и затем полученный гетерологически продукт мог быть очищен и проверен на функциональность.
Вы только что посмотрели обзор генной инженерии от JoVE. В этом видео мы обсудили историю генной инженерии, рассмотрели основные вопросы, инструменты в этой области и представили несколько примеров применения генной инженерии. Как всегда, спасибо за просмотр!
Генная инженерия – это целенаправленное изменение ДНК организма. Достижения в этой области позволили ученым создавать генетически модифицированные клетки и организмы для биомедицинских исследований и сельскохозяйственных целей. Тем не менее, применение генетических технологий для использования в качестве терапевтических средств у людей, известное как генная терапия, все еще находится в стадии разработки.
В этом видео мы обсудим некоторые важные открытия в истории генной инженерии, основные вопросы, которые изучаются сегодня, важные инструменты для изменения генома организма и несколько применений этих технологий.
Давайте начнем с обзора истории генной инженерии.
Способность ученых напрямую манипулировать генами зависела от разгадки идентичности генетического материала. В 1928 году Фредерик Гриффит заметил, что введение мышам смеси убитых теплом вирулентных бактерий и живого, но невирулентного штамма приводит к заболеванию, что привело его к гипотезе о «трансформирующем принципе», который передается от мертвых к живым бактериям.
В 1944 году Освальд Эйвери, Колин Маклауд и Маклин Маккарти определили, что ДНК бактерий ответственна за эту трансформацию. Результат был подтвержден в 1952 году, когда Альфред Херши и Марта Чейз использовали радиоактивно меченый бактериофаг, чтобы показать, что именно ДНК вируса, а не белок, передается во время заражения бактериальных клеток.
Также в 1952 году Джошуа Ледерберг выдвинул гипотезу о существовании плазмид — небольших круглых кусочков ДНК, которые могут передаваться между бактериями. Примерно в то же время он также описал трансдукцию, при которой вирусы действуют как векторы для передачи ДНК между клетками.
Начиная примерно с 1970 года, такие исследователи, как Гамильтон Смит, начали открывать некоторые практические «инструменты» генной инженерии, такие как эндонуклеазы рестрикции, которые «разрезают» ДНК в определенных последовательностях. Используя эти инструменты, в 1972 году Пол Берг сгенерировал первую «рекомбинантную» молекулу ДНК, соединив ДНК двух разных вирусов, а параллельно Стэнли Коэн и Герберт Бойер создали первый рекомбинантный организм, поместив ген устойчивости к антибиотикам в плазмиду и превратив эту конструкцию в бактерии E. coli.
В 1973 году Рудольф Яниш создал первый трансгенный многоклеточный организм, мышь, содержащую вирусную ДНК SV40, хотя только в 1981 году несколько других лабораторий создали первых трансгенных мышей, способных передавать вставленные гены своему потомству. В середине 1980-х годов Марио Капекки и Оливер Смитис впервые установили, что гомологичная рекомбинация может быть использована для специфического нацеливания на гены, а в 1989 году использовали этот метод для создания первой нокаутной мыши, у которой ген становится нефункциональным.
Далее давайте рассмотрим некоторые ключевые вопросы генной инженерии.
Одной из неотъемлемых областей исследований является определение наилучшего метода модификации генома организма. Необходимо учитывать ряд факторов, в том числе эффективность процесса модификации, а также необходимость нацеливания модификации на конкретные гены, чтобы свести к минимуму риски непреднамеренных изменений в клеточной ДНК.
Для того чтобы модифицировать геном клетки-хозяина, искусственно собранная последовательность ДНК для осуществления этой модификации, известная как «генетическая конструкция», должна быть успешно доставлена в эту клетку. Исследования в этой области направлены на максимизацию эффективности при ограничении цитотоксичности. На уровне организмов исследователи изучают, как модифицировать векторы, такие как ретровирусные частицы или наночастицы, чтобы улучшить доставку конструктов к целевым клеточным популяциям.
Наконец, существует большой интерес к тому, может ли генная инженерия быть успешно применена в сельском хозяйстве или в терапевтических целях. Эти технологии использовались для создания мощных исследовательских инструментов, таких как мыши с удаленными или «нокаутированными генами», или для внедрения простых, единичных признаков, таких как устойчивость к гербицидам, в сельскохозяйственные культуры. Тем не менее, сложные проблемы, такие как выращивание сельскохозяйственных культур, которые процветают в неблагоприятных условиях, вероятно, потребуют одновременной модификации нескольких путей. Кроме того, разработка генной терапии для лечения генетических заболеваний, требующая безопасной и эффективной доставки генетических конструкций в клетки человека, остается сложной задачей.
Давайте теперь рассмотрим инструменты и технологии генной инженерии, которые используют исследователи.
Классическим методом создания генетических конструкций является клонирование на основе ферментов рестрикции, при котором фрагменты ДНК расщепляются, а затем рекомбинируются в определенном порядке с использованием ДНК-лигазы для создания новой плазмиды. К более новым методам относится рекомбинирование, при котором используется гомологичная рекомбинация для выделения и обмена фрагментами ДНК без необходимости использования сайтов расщепления ферментов рестрикции.
ДНК может быть доставлена в клетки с помощью ряда методов. Трансформация или трансфекция — это процесс попадания голой ДНК в бактериальные или эукариотические клетки соответственно. Двухвалентные катионы, такие как кальций, могут сделать клеточные мембраны более пористыми, что увеличит поглощение экзогенных молекул ДНК. Электропорация использует электрическое поле для выполнения той же задачи, в то время как липидные наночастицы, окружающие ДНК, могут сливаться с клеточной мембраной и высвобождать ее полезную нагрузку. Трансдукция относится к переносу ДНК вирусным вектором, таким как лентивирус.
Внедрение генетических конструкций в многоклеточные организмы требует дополнительных соображений. При наличии нескольких типов клеток целевые векторы, такие как вирусы или наночастицы, увеличивают специфичность доставки клеток. В растениях исследователи кооптировали агробактерии, растительные патогены, способные переносить ДНК в клетки растений, в качестве инструмента доставки генов. «Биолистика» относится к использованию «генной пушки» для доставки покрытых ДНК золотых шариков в клетки.
Наконец, доставленные конструкции ДНК должны вносить постоянные изменения в геном хозяина для достижения долгосрочных эффектов. Это может произойти путем случайной интеграции доставленной конструкции ДНК в ДНК хозяина, которая может быть усилена путем маркировки конструкции сайтами узнавания ферментов ДНК, называемых транспозазами. С другой стороны, такие методы, как нацеливание на гены через гомологичную рекомбинацию, позволяют интегрировать их в конкретные геномные сайты. Последние достижения в методах, известных как редактирование генома, в котором используются специально разработанные нуклеазы для создания двухцепочечных разрывов в определенных локусах, значительно повышают эффективность нацеливания генов.
Теперь давайте посмотрим, как сегодня применяются технологии генной инженерии.
Клеточные функции у эукариот разделены на органеллы, и нацеливание экспрессии трансгенного белка на отдельные компартменты может обеспечить более специфические биологические эффекты. В этом эксперименте исследователи создали репортерную конструкцию, помеченную GFP, используя метод сборки Гибсона, где гомологичные области перекрытия между несколькими продуктами ПЦР позволяют создать полную конструкцию без использования ферментов рестрикции. Для доставки этих конструкций в клетки растений использовалась биолистическая трансфекция, и исследователи смогли продемонстрировать экспрессию GFP, направленную на хлоропласт.
Раковые клетки часто чрезмерно экспрессируют поверхностные рецепторы, на которые исследователи могут воздействовать с помощью генной терапии. Здесь ученые создали модель рака мочевого пузыря человека у мышей. Затем следует местная доставка аденовирусного вектора к клеткам рака мочевого пузыря. Наблюдение за экспрессией люциферазы в раковых клетках указывало на успешную доставку репортерного гена.
Наконец, достигнут прогресс в создании полных биологических путей в организме-мишени. Здесь каждый ген биосинтетического пути антибиотика эритромицина был выделен из бактерии-хозяина, Saccharopolyspora erythraea, с помощью ПЦР и объединен в опероноподобные конструкции, где ряд генов находится под контролем одних и тех же регуляторных элементов для обеспечения оптимальной экспрессии. Затем эти конструкции преобразовывались в E. coli, чтобы воссоздать путь синтеза, и затем полученный гетерологически продукт мог быть очищен и проверен на функциональность.
Вы только что посмотрели обзор генной инженерии от JoVE. В этом видео мы обсудили историю генной инженерии, рассмотрели основные вопросы, инструменты в этой области и представили несколько примеров применения генной инженерии. Как всегда, спасибо за просмотр!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What key discoveries established DNA as the genetic material?
Frederick Griffith's 1928 experiments with bacteria suggested a transforming principle. Oswald Avery, Colin Macleod, and Maclyn McCarty identified DNA as responsible for transformation in 1944. Alfred Hershey and Martha Chase confirmed in 1952 that viral DNA, not protein, transmits genetic information during bacterial infection using radioactively labeled bacteriophage.
Q2: How do restriction enzymes and DNA ligases work together in genetic engineering?
Restriction enzymes cut DNA at specific sequences, breaking it into fragments. DNA ligases then join these fragments in desired orders to create new plasmids. This restriction enzyme-based cloning method was foundational for generating genetic constructs before newer techniques like recombineering and gene targeting emerged.
Q3: What are the main methods for delivering DNA into cells?
Transformation and transfection use divalent cations like calcium to increase cell membrane permeability for naked DNA uptake. Electroporation applies electric fields for the same purpose. Lipid nanoparticles surround DNA and fuse with membranes, while transduction uses viral vectors like lentiviruses to transfer genetic material into cells.
Q4: How do homologous recombination and genome editing differ in targeting genes?
Homologous recombination allows integration into specific genomic sites by matching DNA sequences, enabling precise gene targeting. Genome editing uses custom-designed nucleases to generate double-strand breaks at specific loci, greatly improving targeting efficiency. Both techniques minimize off-target effects compared to random DNA integration.
Q5: What is the difference between knockout mice and transgenic mice?
Transgenic mice contain inserted foreign genes, like SV40 viral DNA, and can pass these genes to offspring. Knockout mice have specific genes rendered nonfunctional through homologous recombination. Rudolf Jaenisch created the first transgenic mouse in 1973, while Mario Capecchi and Oliver Smithies generated the first knockout mouse in 1989.
Q6: How is genetic engineering applied to treat cancer using gene therapy?
Researchers target cancer cells that over-express surface receptors using adenoviral vectors. In bladder cancer models, topical delivery of the vector to cancer cells enables successful gene transfer. Luciferase reporter genes confirm successful delivery, demonstrating how gene therapy can target specific cancer cell populations for therapeutic intervention.
Q7: What challenges remain in applying genetic engineering to complex agricultural problems?
Simple traits like herbicide resistance are achievable, but complex problems such as stress tolerance require modifying multiple pathways simultaneously. Safe and efficient delivery of genetic constructs to target cells remains challenging. Additionally, minimizing off-target effects and ensuring long-term stability of modifications are critical considerations for successful agricultural applications.