Рекомбинация и нацеливание на гены
Одним из наиболее широко используемых инструментов в современной биологии является молекулярное клонирование с помощью ферментов рестрикции, которые с…
Клонирование путем гомологичной рекомбинации, или рекомбинирования, значительно улучшило способность исследователей проводить высокопроизводительную генную инженерию. Классическое молекулярное клонирование требует расщепления векторов и вставок с одними и теми же ферментами рестрикции для получения совместимых концов для «рекомбинации», но особенно при попытке выделить область из более длинной последовательности, такой как участок геномной ДНК, не всегда существуют ферменты рестрикции, которые будут уникальным образом разрезать интересующую область. и не в пределах региона или где-либо еще в последовательности. Избегая необходимости в этих сайтах ограничения, рекомбинирование обеспечивает гораздо более эффективный и экономичный способ создания генно-инженерных конструкций.
В этом видео мы познакомимся с принципами генетической рекомбинации, предоставим общий протокол рекомбинации вектора, нацеленного на гены, и обсудим несколько применений этих технологий.
Для начала давайте обсудим, что такое рекомбинация и как ее можно применить.
Генетическая рекомбинация влечет за собой обмен информацией между молекулами ДНК. При «гомологичной рекомбинации» происходит обмен относительно большими участками сходных или идентичных последовательностей ДНК. Клетки используют этот процесс для восстановления двухцепочечных разрывов, а размножающиеся половым путем эукариоты также осуществляют его между гомологичными хромосомами во время мейоза для увеличения генетического разнообразия.
Гомологичная рекомбинация используется для ряда экспериментальных целей, в том числе для модификации специфических эндогенных локусов в клетках, называемой «генным таргетингом». Она также применяется для инженерии генетических конструкций, процесса, называемого «рекомбинированием», что особенно полезно для модификации больших участков ДНК с целью нацеливания на геном организма. Для этого исследователи могут использовать «геномные библиотеки» или наборы векторов, каждый из которых содержит длинные фрагменты геномной ДНК. Были созданы различные типы библиотек с разной емкостью, обычно размножающиеся в бактериальных клонах, которые можно заказать в коммерческих или некоммерческих репозиториях. Одним из наиболее часто используемых типов геномной библиотеки является бактериальная искусственная хромосома или BAC, которая может иметь размер вставки от 150 до 350 килооснований.
Для того, чтобы рекомбинировать конструкцию, ученым нужен организм, в котором происходит гомологичная рекомбинация. Дрожжи Saccharomyces cerevisiae по своей природе являются «рекомбинационно-компетентными» и могут легко проводить гомологичную рекомбинацию между вектором и вставкой. Другая широко применяемая система использует «красные» белки бактериофага лямбда, который восстанавливается в бактериях E. coli. Векторы могут быть рекомбинированы либо в ранее созданных бактериальных штаммах, экспрессирующих красный, либо плазмида, кодирующая компоненты системы Red, может быть совместно трансформирована с рекомбинирующими субстратами в бактерии.
Теперь давайте рассмотрим протокол создания вектора, нацеленного на гены, путем рекомбинации.
Целью этого протокола является создание генетически модифицированной мыши с целенаправленными изменениями в определенном гене. Вкратце, желаемые модификации интересующего гена вносятся в BAC; Модифицированная последовательность «извлекается» в вектор-мишень, и этот вектор трансфицируется в эмбриональные стволовые клетки для нацеливания на гены. Затем стволовые клетки могут быть использованы для создания генетически модифицированного животного. Инструкции по этой заключительной процедуре см. в обучающем видео JoVE "Генная инженерия модельных организмов".
Для начала идентифицируется и заказывается клон BAC, содержащий интересующую геномную последовательность. Затем проектируются плечи гомологии, или олигонуклеотиды, содержащие 30-50 гомологичных областей пар оснований. Эти олигонуклеотиды используются в качестве праймеров в реакциях ПЦР для получения «кассет» ДНК, используемых для модификации интересующего гена. Эти кассеты обычно содержат, например, гены устойчивости к антибиотикам, которые могут действовать как маркеры отбора, которые могут быть легко амплифицированы из многих общедоступных плазмид. Затем бактериальный клон BAC преобразуется, например, путем электропорации, с плазмидой, кодирующей компоненты системы Red, за которой следуют кассеты, содержащие гомологическое оружие. Затем бактерии инкубируются при соответствующей температуре, чтобы вызвать рекомбинацию.
Чтобы восстановить модифицированную последовательность из BAC, вектор «восстановления» линеаризуют и амплифицируют с помощью праймеров, содержащих плечи гомологии, которые охватывают несколько килооснований вокруг сайта модификации. Этот векторный костяк трансформируется в бактериальный клон BAC, и снова индуцируется рекомбинация. Вектор будет «исправлен пробелом» путем «извлечения» соответствующей последовательности из BAC. В результате получается вектор-мишень для генов, содержащий представляющую интерес модифицированную последовательность, а также участки, которые гомологичны геномной ДНК, окружающей модифицированную последовательность. Затем этот вектор может быть очищен, линеаризован и введен в эмбриональные стволовые клетки, где эндогенный механизм гомологичной рекомбинации будет нацеливать модифицированную последовательность на соответствующий локус, тем самым изменяя геном хозяина.
Давайте теперь рассмотрим некоторые области применения инженерных методов, основанных на рекомбинациях.
Во-первых, исследователи могут использовать рекомбинацию, чтобы быстро и легко сконструировать бактериальный геном, например, для изучения белковых комплексов. В данном случае кассета, кодирующая последовательную пептидную аффинную метку, а также маркер селекции резистентности к канамицину, была сконструирована для рекомбинации в 3¢ конце интересующего гена. Затем этот вектор был введен в красный «рекомбинационно-компетентный» E. coli, и успешные рекомбинанты были выделены с использованием селективных сред. Меченые белковые комплексы были биохимически очищены с использованием белков, которые прочно связываются с метками, и проанализированы с помощью масс-спектрометрии для идентификации партнеров по взаимодействию интересующего белка.
Рекомбинирование и нацеливание на гены также могут быть использованы для модификации генома паразитических организмов, таких как облигатный внутриклеточный паразит Toxoplasma gondii, который вызывает заболевание токсоплазмозом. В этом исследовании вектор-мишень был рекомбинирован в дрожжах, где геномные последовательности, фланкирующие интересующий ген, были размещены вокруг маркера отбора. Затем вектор линеаризировался и электропорировался в паразитов. Для выделения успешных рекомбинантов использовалось пальирование предельного разведения в селективных средах, в которых гомологичный рекомбинационный механизм паразита заменял геномную последовательность на сконструированную, тем самым удаляя интересующий ген. ПЦР целевого региона подтвердила положительные рекомбинационные события.
Наконец, была разработана процедура, известная как субклонирование плюс вставка, или SPI, в которой восстановление зазоров и вставка кассеты происходят одновременно, что делает процесс рекомбинации более простым и гибким. Решающее значение для успеха этого процесса имеет правильная конструкция плеч множественных гомологий, которые при давлении до 180 п.о. длиннее, чем при обычной рекомбинации, чтобы повысить эффективность рекомбинации. После включения гомологических плеч в субклонирующую плазмиду и вставные кассеты методом ПЦР, они были преобразованы вместе в клон BAC, экспрессирующий красный, и была индуцирована рекомбинация. Успешно рекомбинированные конструкции затем были идентифицированы с помощью ПЦР или анализа рестрикционного дайджеста.
Вы только что посмотрели видео JoVE о рекомбинации. В этом видео мы обсудили принципы рекомбинации и то, как они могут быть использованы в генной инженерии, протокол проекта рекомбинации и, наконец, несколько применений этих методов. Как всегда, спасибо за просмотр!
Клонирование путем гомологичной рекомбинации, или рекомбинирования, значительно улучшило способность исследователей проводить высокопроизводительную генную инженерию. Классическое молекулярное клонирование требует расщепления векторов и вставок с одними и теми же ферментами рестрикции для получения совместимых концов для «рекомбинации», но особенно при попытке выделить область из более длинной последовательности, такой как участок геномной ДНК, не всегда существуют ферменты рестрикции, которые будут уникальным образом разрезать интересующую область. и не в пределах региона или где-либо еще в последовательности. Избегая необходимости в этих сайтах ограничения, рекомбинирование обеспечивает гораздо более эффективный и экономичный способ создания генно-инженерных конструкций.
В этом видео мы познакомимся с принципами генетической рекомбинации, предоставим общий протокол рекомбинации вектора, нацеленного на гены, и обсудим несколько применений этих технологий.
Для начала давайте обсудим, что такое рекомбинация и как ее можно применить.
Генетическая рекомбинация влечет за собой обмен информацией между молекулами ДНК. При «гомологичной рекомбинации» происходит обмен относительно большими участками сходных или идентичных последовательностей ДНК. Клетки используют этот процесс для восстановления двухцепочечных разрывов, а размножающиеся половым путем эукариоты также осуществляют его между гомологичными хромосомами во время мейоза для увеличения генетического разнообразия.
Гомологичная рекомбинация используется для ряда экспериментальных целей, в том числе для модификации специфических эндогенных локусов в клетках, называемой «генным таргетингом». Она также применяется для инженерии генетических конструкций, процесса, называемого «рекомбинированием», что особенно полезно для модификации больших участков ДНК с целью нацеливания на геном организма. Для этого исследователи могут использовать «геномные библиотеки» или наборы векторов, каждый из которых содержит длинные фрагменты геномной ДНК. Были созданы различные типы библиотек с разной емкостью, обычно размножающиеся в бактериальных клонах, которые можно заказать в коммерческих или некоммерческих репозиториях. Одним из наиболее часто используемых типов геномной библиотеки является бактериальная искусственная хромосома или BAC, которая может иметь размер вставки от 150 до 350 килооснований.
Для того, чтобы рекомбинировать конструкцию, ученым нужен организм, в котором происходит гомологичная рекомбинация. Дрожжи Saccharomyces cerevisiae по своей природе являются «рекомбинационно-компетентными» и могут легко проводить гомологичную рекомбинацию между вектором и вставкой. Другая широко применяемая система использует «красные» белки бактериофага лямбда, который восстанавливается в бактериях E. coli. Векторы могут быть рекомбинированы либо в ранее созданных бактериальных штаммах, экспрессирующих красный, либо плазмида, кодирующая компоненты системы Red, может быть совместно трансформирована с рекомбинирующими субстратами в бактерии.
Теперь давайте рассмотрим протокол создания вектора, нацеленного на гены, путем рекомбинации.
Целью этого протокола является создание генетически модифицированной мыши с целенаправленными изменениями в определенном гене. Вкратце, желаемые модификации интересующего гена вносятся в BAC; Модифицированная последовательность «извлекается» в вектор-мишень, и этот вектор трансфицируется в эмбриональные стволовые клетки для нацеливания на гены. Затем стволовые клетки могут быть использованы для создания генетически модифицированного животного. Инструкции по этой заключительной процедуре см. в обучающем видео JoVE "Генная инженерия модельных организмов".
Для начала идентифицируется и заказывается клон BAC, содержащий интересующую геномную последовательность. Затем проектируются плечи гомологии, или олигонуклеотиды, содержащие 30-50 гомологичных областей пар оснований. Эти олигонуклеотиды используются в качестве праймеров в реакциях ПЦР для получения «кассет» ДНК, используемых для модификации интересующего гена. Эти кассеты обычно содержат, например, гены устойчивости к антибиотикам, которые могут действовать как маркеры отбора, которые могут быть легко амплифицированы из многих общедоступных плазмид. Затем бактериальный клон BAC преобразуется, например, путем электропорации, с плазмидой, кодирующей компоненты системы Red, за которой следуют кассеты, содержащие гомологическое оружие. Затем бактерии инкубируются при соответствующей температуре, чтобы вызвать рекомбинацию.
Чтобы восстановить модифицированную последовательность из BAC, вектор «восстановления» линеаризуют и амплифицируют с помощью праймеров, содержащих плечи гомологии, которые охватывают несколько килооснований вокруг сайта модификации. Этот векторный костяк трансформируется в бактериальный клон BAC, и снова индуцируется рекомбинация. Вектор будет «исправлен пробелом» путем «извлечения» соответствующей последовательности из BAC. В результате получается вектор-мишень для генов, содержащий представляющую интерес модифицированную последовательность, а также участки, которые гомологичны геномной ДНК, окружающей модифицированную последовательность. Затем этот вектор может быть очищен, линеаризован и введен в эмбриональные стволовые клетки, где эндогенный механизм гомологичной рекомбинации будет нацеливать модифицированную последовательность на соответствующий локус, тем самым изменяя геном хозяина.
Давайте теперь рассмотрим некоторые области применения инженерных методов, основанных на рекомбинациях.
Во-первых, исследователи могут использовать рекомбинацию, чтобы быстро и легко сконструировать бактериальный геном, например, для изучения белковых комплексов. В данном случае кассета, кодирующая последовательную пептидную аффинную метку, а также маркер селекции резистентности к канамицину, была сконструирована для рекомбинации в 3¢ конце интересующего гена. Затем этот вектор был введен в красный «рекомбинационно-компетентный» E. coli, и успешные рекомбинанты были выделены с использованием селективных сред. Меченые белковые комплексы были биохимически очищены с использованием белков, которые прочно связываются с метками, и проанализированы с помощью масс-спектрометрии для идентификации партнеров по взаимодействию интересующего белка.
Рекомбинирование и нацеливание на гены также могут быть использованы для модификации генома паразитических организмов, таких как облигатный внутриклеточный паразит Toxoplasma gondii, который вызывает заболевание токсоплазмозом. В этом исследовании вектор-мишень был рекомбинирован в дрожжах, где геномные последовательности, фланкирующие интересующий ген, были размещены вокруг маркера отбора. Затем вектор линеаризировался и электропорировался в паразитов. Для выделения успешных рекомбинантов использовалось пальирование предельного разведения в селективных средах, в которых гомологичный рекомбинационный механизм паразита заменял геномную последовательность на сконструированную, тем самым удаляя интересующий ген. ПЦР целевого региона подтвердила положительные рекомбинационные события.
Наконец, была разработана процедура, известная как субклонирование плюс вставка, или SPI, в которой восстановление зазоров и вставка кассеты происходят одновременно, что делает процесс рекомбинации более простым и гибким. Решающее значение для успеха этого процесса имеет правильная конструкция плеч множественных гомологий, которые при давлении до 180 п.о. длиннее, чем при обычной рекомбинации, чтобы повысить эффективность рекомбинации. После включения гомологических плеч в субклонирующую плазмиду и вставные кассеты методом ПЦР, они были преобразованы вместе в клон BAC, экспрессирующий красный, и была индуцирована рекомбинация. Успешно рекомбинированные конструкции затем были идентифицированы с помощью ПЦР или анализа рестрикционного дайджеста.
Вы только что посмотрели видео JoVE о рекомбинации. В этом видео мы обсудили принципы рекомбинации и то, как они могут быть использованы в генной инженерии, протокол проекта рекомбинации и, наконец, несколько применений этих методов. Как всегда, спасибо за просмотр!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is homologous recombination and how does it differ from classical molecular cloning?
Homologous recombination is the exchange of DNA between molecules based on stretches of similar or identical sequences. Unlike classical molecular cloning, which requires specific restriction enzyme sites to generate compatible ends, homologous recombination avoids this limitation. This makes recombineering a more efficient and cost-effective approach for engineering and recombinant dna technology, especially when restriction sites are unavailable around the region of interest.
Q2: What are the key components needed to perform a recombineering experiment?
Recombineering requires a recombination-competent organism, such as yeast Saccharomyces cerevisiae or E. coli expressing Red proteins from bacteriophage lambda. Researchers also need genomic libraries containing long DNA fragments, with bacterial artificial chromosomes (BACs) being commonly used because they carry insert sizes between 150-350 kilobases. These components enable efficient homologous recombination between vectors and inserts.
Q3: How are homology arms designed and used in the recombineering protocol?
Homology arms are oligonucleotides containing 30-50 basepair homologous regions designed to flank the target sequence. These serve as primers in PCR reactions to generate DNA cassettes that modify the gene of interest. In advanced procedures like subcloning plus insertion (SPI), homology arms can be up to 180 bp long to increase recombination efficiency, making the process more flexible and reliable.
Q4: What is the purpose of a retrieval vector in creating a gene-targeting construct?
A retrieval vector is linearized and amplified using primers containing homology arms that span several kilobases around the modification site. When transformed into the BAC clone, the vector undergoes gap-repair by retrieving the modified sequence from the BAC. This produces a gene-targeting vector containing the modified sequence plus regions homologous to genomic DNA, which can then be introduced into embryonic stem cells for targeted genome modification.
Q5: How can recombineering be applied to study protein interactions in bacteria?
Researchers design cassettes encoding sequential peptide affinity tags and selection markers like kanamycin resistance, then recombineer them into the 3' end of target genes in Red-competent E. coli. Successful recombinants are isolated using selective media. The tagged protein complexes are then biochemically purified using proteins that bind to the tags and analyzed by mass spectrometry to identify interaction partners.
Q6: What advantages does recombineering offer for modifying parasite genomes?
Recombineering enables precise genome modification in parasitic organisms like Toxoplasma gondii. A targeting vector with genomic sequences flanking the gene of interest is recombineered in yeast, then linearized and electroporated into parasites. The parasite's homologous recombination machinery replaces the genomic sequence with the engineered version, effectively deleting or modifying target genes. PCR confirms successful recombination events.
Q7: Why is proper homology arm design critical for the success of subcloning plus insertion (SPI)?
In SPI, gap repair and cassette insertion occur simultaneously, requiring precise homology arm design to ensure efficient recombination. Homology arms in SPI are longer, up to 180 bp compared to conventional recombineering, increasing recombination efficiency and success rates. After PCR incorporation into subcloning plasmids and insertion cassettes, they are transformed into Red-expressing BAC clones and verified by detection and quantification nucleic acids or restriction digest analysis.