Рекомбинация и нацеливание на гены

Клонирование путем гомологичной рекомбинации, или рекомбинирования, значительно улучшило способность исследователей проводить высокопроизводительную генную инженерию. Классическое молекулярное клонирование требует расщепления векторов и вставок с одними и теми же ферментами рестрикции для получения совместимых концов для «рекомбинации», но особенно при попытке выделить область из более длинной последовательности, такой как участок геномной ДНК, не всегда существуют ферменты рестрикции, которые будут уникальным образом разрезать интересующую область. и не в пределах региона или где-либо еще в последовательности. Избегая необходимости в этих сайтах ограничения, рекомбинирование обеспечивает гораздо более эффективный и экономичный способ создания генно-инженерных конструкций.

В этом видео мы познакомимся с принципами генетической рекомбинации, предоставим общий протокол рекомбинации вектора, нацеленного на гены, и обсудим несколько применений этих технологий.

Для начала давайте обсудим, что такое рекомбинация и как ее можно применить.

Генетическая рекомбинация влечет за собой обмен информацией между молекулами ДНК. При «гомологичной рекомбинации» происходит обмен относительно большими участками сходных или идентичных последовательностей ДНК. Клетки используют этот процесс для восстановления двухцепочечных разрывов, а размножающиеся половым путем эукариоты также осуществляют его между гомологичными хромосомами во время мейоза для увеличения генетического разнообразия.

Гомологичная рекомбинация используется для ряда экспериментальных целей, в том числе для модификации специфических эндогенных локусов в клетках, называемой «генным таргетингом». Она также применяется для инженерии генетических конструкций, процесса, называемого «рекомбинированием», что особенно полезно для модификации больших участков ДНК с целью нацеливания на геном организма. Для этого исследователи могут использовать «геномные библиотеки» или наборы векторов, каждый из которых содержит длинные фрагменты геномной ДНК. Были созданы различные типы библиотек с разной емкостью, обычно размножающиеся в бактериальных клонах, которые можно заказать в коммерческих или некоммерческих репозиториях. Одним из наиболее часто используемых типов геномной библиотеки является бактериальная искусственная хромосома или BAC, которая может иметь размер вставки от 150 до 350 килооснований.

Для того, чтобы рекомбинировать конструкцию, ученым нужен организм, в котором происходит гомологичная рекомбинация. Дрожжи Saccharomyces cerevisiae по своей природе являются «рекомбинационно-компетентными» и могут легко проводить гомологичную рекомбинацию между вектором и вставкой. Другая широко применяемая система использует «красные» белки бактериофага лямбда, который восстанавливается в бактериях E. coli. Векторы могут быть рекомбинированы либо в ранее созданных бактериальных штаммах, экспрессирующих красный, либо плазмида, кодирующая компоненты системы Red, может быть совместно трансформирована с рекомбинирующими субстратами в бактерии.

Теперь давайте рассмотрим протокол создания вектора, нацеленного на гены, путем рекомбинации.

Целью этого протокола является создание генетически модифицированной мыши с целенаправленными изменениями в определенном гене. Вкратце, желаемые модификации интересующего гена вносятся в BAC; Модифицированная последовательность «извлекается» в вектор-мишень, и этот вектор трансфицируется в эмбриональные стволовые клетки для нацеливания на гены. Затем стволовые клетки могут быть использованы для создания генетически модифицированного животного. Инструкции по этой заключительной процедуре см. в обучающем видео JoVE "Генная инженерия модельных организмов".

Для начала идентифицируется и заказывается клон BAC, содержащий интересующую геномную последовательность. Затем проектируются плечи гомологии, или олигонуклеотиды, содержащие 30-50 гомологичных областей пар оснований. Эти олигонуклеотиды используются в качестве праймеров в реакциях ПЦР для получения «кассет» ДНК, используемых для модификации интересующего гена. Эти кассеты обычно содержат, например, гены устойчивости к антибиотикам, которые могут действовать как маркеры отбора, которые могут быть легко амплифицированы из многих общедоступных плазмид. Затем бактериальный клон BAC преобразуется, например, путем электропорации, с плазмидой, кодирующей компоненты системы Red, за которой следуют кассеты, содержащие гомологическое оружие. Затем бактерии инкубируются при соответствующей температуре, чтобы вызвать рекомбинацию.

Чтобы восстановить модифицированную последовательность из BAC, вектор «восстановления» линеаризуют и амплифицируют с помощью праймеров, содержащих плечи гомологии, которые охватывают несколько килооснований вокруг сайта модификации. Этот векторный костяк трансформируется в бактериальный клон BAC, и снова индуцируется рекомбинация. Вектор будет «исправлен пробелом» путем «извлечения» соответствующей последовательности из BAC. В результате получается вектор-мишень для генов, содержащий представляющую интерес модифицированную последовательность, а также участки, которые гомологичны геномной ДНК, окружающей модифицированную последовательность. Затем этот вектор может быть очищен, линеаризован и введен в эмбриональные стволовые клетки, где эндогенный механизм гомологичной рекомбинации будет нацеливать модифицированную последовательность на соответствующий локус, тем самым изменяя геном хозяина.

Давайте теперь рассмотрим некоторые области применения инженерных методов, основанных на рекомбинациях.

Во-первых, исследователи могут использовать рекомбинацию, чтобы быстро и легко сконструировать бактериальный геном, например, для изучения белковых комплексов. В данном случае кассета, кодирующая последовательную пептидную аффинную метку, а также маркер селекции резистентности к канамицину, была сконструирована для рекомбинации в 3¢ конце интересующего гена. Затем этот вектор был введен в красный «рекомбинационно-компетентный» E. coli, и успешные рекомбинанты были выделены с использованием селективных сред. Меченые белковые комплексы были биохимически очищены с использованием белков, которые прочно связываются с метками, и проанализированы с помощью масс-спектрометрии для идентификации партнеров по взаимодействию интересующего белка.

Рекомбинирование и нацеливание на гены также могут быть использованы для модификации генома паразитических организмов, таких как облигатный внутриклеточный паразит Toxoplasma gondii, который вызывает заболевание токсоплазмозом. В этом исследовании вектор-мишень был рекомбинирован в дрожжах, где геномные последовательности, фланкирующие интересующий ген, были размещены вокруг маркера отбора. Затем вектор линеаризировался и электропорировался в паразитов. Для выделения успешных рекомбинантов использовалось пальирование предельного разведения в селективных средах, в которых гомологичный рекомбинационный механизм паразита заменял геномную последовательность на сконструированную, тем самым удаляя интересующий ген. ПЦР целевого региона подтвердила положительные рекомбинационные события.

Наконец, была разработана процедура, известная как субклонирование плюс вставка, или SPI, в которой восстановление зазоров и вставка кассеты происходят одновременно, что делает процесс рекомбинации более простым и гибким. Решающее значение для успеха этого процесса имеет правильная конструкция плеч множественных гомологий, которые при давлении до 180 п.о. длиннее, чем при обычной рекомбинации, чтобы повысить эффективность рекомбинации. После включения гомологических плеч в субклонирующую плазмиду и вставные кассеты методом ПЦР, они были преобразованы вместе в клон BAC, экспрессирующий красный, и была индуцирована рекомбинация. Успешно рекомбинированные конструкции затем были идентифицированы с помощью ПЦР или анализа рестрикционного дайджеста.

Вы только что посмотрели видео JoVE о рекомбинации. В этом видео мы обсудили принципы рекомбинации и то, как они могут быть использованы в генной инженерии, протокол проекта рекомбинации и, наконец, несколько применений этих методов. Как всегда, спасибо за просмотр!