Редактирование генома

Редактирование генома включает в себя методы, с помощью которых исследователи могут «редактировать» или изменять определенную последовательность ДНК. Эти методы основаны на создании небольших «разрезов» в ДНК, которые клетки пытаются восстановить, часто не полностью. Таким образом, ученые могут индуцировать мутации в целевых последовательностях с большей эффективностью по сравнению с классическим нацеливанием генов.

В этом видео мы рассмотрим принципы, лежащие в основе трех методов редактирования генома, и обсудим обобщенный протокол для одного из них, системы CRISPR-Cas9. Затем мы рассмотрим некоторые варианты применения этих методов.

Во-первых, давайте рассмотрим принципы, лежащие в основе редактирования генома.

Классическим методом введения генетических изменений в конкретные последовательности в геноме является нацеливание на гены путем гомологичной рекомбинации, где включение гомологичных последовательностей в целевую конструкцию приводит к «переключению» эндогенного гена на измененную версию.

Как и нацеливание на гены, редактирование генома может быть нацелено на изменения в конкретных участках ДНК, но оно может делать это с гораздо большей эффективностью, устанавливая желаемые мутации в большем количестве клеток в любом конкретном эксперименте.

Все методы редактирования генома основаны на способности клетки восстанавливать двухцепочечные разрывы, сделанные в ее ДНК эндонуклеазами. Это повреждение может быть восстановлено с помощью негомологичного соединения концов или NHEJ, когда сломанные концы ДНК повторно запечатываются напрямую; или с помощью исправления, направленного на гомологию, или HDR, где повреждение устраняется путем копирования из гомологичного шаблона. NHEJ обычно не идеален, и может привести к удалению или добавлению нескольких оснований к восстановленной ДНК, что приведет к мутации целевой последовательности. С другой стороны, HDR позволяет исследователям добавлять шаблоны, чтобы направлять конкретные изменения на целевой сайт.

За последние несколько лет были разработаны и популяризированы три основных метода редактирования генома.

В одном из методов исследователи объединяют ДНК-связывающие домены «цинковых пальцев» определенных факторов транскрипции с доменом, расщепляющим ДНК эндонуклеазы FokI. Поскольку каждый домен цинкового пальца распознает определенный триплет нуклеотидов, эти домены могут быть искусственно связаны друг с другом для создания нуклеаз цинковых пальцев, или ZFN, которые нацелены на уникальные последовательности ДНК.

Аналогичным образом, нуклеазы, называемые «TALENs», присоединяются к FokI к вариабельным ДНК-связывающим доменам бактериальных белков, называемым эффекторами-активаторами транскрипции, или TALE. Каждый домен TALE распознает одно уникальное основание ДНК, придавая TALEN специфичность последовательности.

Наконец, система CRISPR-Cas9 использует компоненты прокариотической иммунной системы, которая обычно защищает своего хозяина от вторжения чужеродных генетических материалов, таких как вирусы или плазмиды. В этой системе фрагменты вторгшейся чужеродной ДНК, называемые «протоспейсерами», встраиваются в локус CRISPR, который затем транскрибируется и обрабатывается механизмом белковой РНК в небольшие РНК, называемые крРНК.

Ученые используют механизм CRISPR для целей редактирования генома, разрабатывая crRNA-подобные направляющие последовательности, известные как «single guide» или sgRNA, которые могут быть использованы для нацеливания Cas9 практически на любую желаемую генетическую последовательность в клетках млекопитающих или других системах, представляющих интерес. Простая настраиваемость системы CRISPR-Cas9 на основе последовательности РНК обеспечивает явные преимущества по сравнению с методами редактирования генома на основе белков, такими как ZFN и TALEN.

Теперь, когда вы узнали о принципах редактирования генома, давайте рассмотрим типичный протокол использования CRISPR для создания целевых генетических изменений в клетках млекопитающих.

Во-первых, выбирается место для редактирования генома. Эта область должна быть короткой — размером примерно 20 пар оснований — и обладать длинным «соседним мотивом протоспейсера» или «PAM» длиной в 3 фута. PAM необходим Cas9 для распознавания и расщепления целевого участка ДНК, а точная последовательность специфична для организма, в котором происходит использование Cas9. После того, как потенциальный сайт был идентифицирован, его следует искать по последовательности генома, чтобы убедиться, что подобные сайты не будут обнаружены в других частях генома, и, таким образом, никакие нецелевые участки генома не будут отредактированы.

Для синтеза направляющей последовательности CRISPR генерируются два олигонуклеотида, один идентичный, а другой комплементарный последовательности-мишени. Дополнительные последовательности включены на их 5'-концах для совместимости с векторами sgRNA. Затем эти олигонуклеотиды смешиваются вместе, денатурируются, а затем отжигаются.

Затем плазмиду, содержащую «скаффолд» sgРНК, разрезают соответствующим ферментом рестрикции, смешивают с синтезированной направляющей последовательностью CRISPR и инкубируют с ферментом лигазой для создания конструкции sgRNA. Затем плазмида может быть преобразована в бактерии и культивирована для амплификации. После очистки от бактерий конструкция CRISPR совместно трансфицируется с конструкцией, кодирующей Cas9, в клетки, геном которых подлежит редактированию. Эти трансфицированные клетки культивируются для формирования клональных колоний.

Геномная ДНК может быть выделена из каждой колонии и проанализирована с помощью ПЦР или секвенирования для скрининга тех, в которых система CRISPR произвела желаемые мутации.

Давайте теперь рассмотрим некоторые способы, с помощью которых ученые используют методы редактирования генома.

Многие исследователи используют редактирование генома для введения репортерных последовательностей в определенные локусы. В этом эксперименте ZFN были использованы для вставки зеленого флуоресцентного белка в ген, который участвует в развитии и выживании нейронов. Исследователи подтвердили, что они правильно нацелились на этот ген, направив стволовые клетки на дифференцировку в нейроны и выполнив двойную иммунофлуоресценцию для GFP и нейрональных маркеров.

Редактирование генома также значительно упростило создание «нокаутных» организмов, в которых ген, представляющий интерес, становится нефункциональным. Здесь исследователи стремились создать мышей с нокаутом, вводя эмбрионам мРНК, кодирующие TALEN, которые нацелены на определенные гены. Последующая эндонуклеазная обработка ДНК мышей, получавших TALEN, позволила исследователям идентифицировать животных с мутациями в обеих копиях целевого гена.

Наконец, редактирование генома может быть использовано для создания больших генетических делеций путем создания двух двухцепочечных разрывов в одной и той же хромосомной области. Эти большие делеции могут быть необходимы, когда функция гена или генетического элемента не может быть нарушена маленькими делециями, созданными с помощью обычных протоколов редактирования генома. Здесь исследователи совместно электропорировали раковые клетки мышей с конструкцией GFP и двумя конструкциями CRISPR, нацеленными на различные области гена, вызывающего рак. Клетки, которые были успешно трансфицированы, которые таким образом излучали сигнал GFP, были выделены с помощью флуоресцентной сортировки клеток, а последующая ПЦР и секвенирование идентифицировали клетки, в которых участок ДНК между двумя сайтами, нацеленными на CRISPR, был удален.

Вы только что посмотрели видео JoVE о редактировании генома. В этой статье мы рассмотрели принципы, лежащие в основе ZFNs, TALEN и CRISPR, изучили общий протокол CRISPR-Cas9 и обсудили, как исследователи используют методы редактирования генома сегодня. Как всегда, спасибо за просмотр!