Сборка и отслеживание развития микробного сообщества в рамках платформы массивов микролистов
June 6th, 2017
Развитие микробных сообществ зависит от сочетания факторов, включая экологическую архитектуру, численность членов, черты и взаимодействия. В этом протоколе описывается синтетическая микроструктурированная среда для одновременного отслеживания тысяч сообществ, содержащихся в ямах фемтолитера, где могут быть аппроксимированы ключевые факторы, такие как размер ниши и ограничение.
Общей целью этого метода является высокопроизводительный параллельный анализ многочленных микробных сообществ в замкнутых средах с использованием кремниевых микролуночных массивов. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он обеспечивает высокопроизводительный высокопараллельный скрининг тонко локализованных микробных взаимодействий, которые важны для промышленности, медицины и окружающей среды. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биомедицины и экологии микроорганизмов, такие как как пространственные ограничения, присущие мелким масштабам, влияют на детерминированные и стохастические параметры развития сообществ и каково их ключевое влияние на численность и организацию микробных членов?
Начните с подготовки массивов микролунок. Во-первых, вырежьте отдельные микролуночные чипы из кремниевых пластин, напечатанных с помощью нескольких массивов, с помощью алмазного начертателя. Каждый отдельный чип содержит подмассивы лунок диаметром от пяти до 100 микрон с тремя различными плотностями расстояния.
На каждой стружке полный мотив лунок также повторяется четыре раза. Затем сделайте увлажненную камеру с помощью коробки для наконечника для пипетки и пропитанной салфеткой PBS. Затем нанесите на каждую чипсу каплю раствора БСА объемом 150 микролитров и выдержите чипсы в коробке в течение часа при комнатной температуре.
Тем временем подготовьте бактерии. Уменьшите культуру и повторно суспендируйте ее в 500 микролитрах свежей среды R2A с двухпроцентным глицерином. Затем измерьте плотность культуры на уровне 600 нанометров и отрегулируйте концентрацию до оптической плотности 0,02.
После инкубации чипсов удалите раствор БСА и трижды промойте чипсы PBS. После промываний просушите стружку газообразным азотом и верните в увлажненную камеру. Далее добавьте в каждую сухую стружку по 150 микролитров суспензии культуры и инкубируйте чипсы в течение часа при четырех градусах Цельсия, чтобы бактерии успели прилипнуть к лункам, но деление клеток любого возможного загрязнения происходит медленно.
Чтобы подготовить чип к визуализации, сначала сделайте покровный лист с агарозным покрытием для каждого чипа. Разжижают небольшой объем агарозы, на каждый покровный лист нужно около пяти миллилитров. Затем промойте одну сторону чехлового стекла этанолом и центрируйте его на предметном стекле вымытой стороной вверх.
Затем расположите две прокладки PDMS толщиной в один миллиметр вдоль длинных краев защитного стекла и сдвиньте защитное стекло так, чтобы один миллиметр свисал с затвора. Теперь налейте на покровную крышку достаточное количество агарозы, чтобы полностью покрыть ее. Затем с помощью второго предметного стекла разровняйте агарозу до равномерной толщины.
Подготовьте несколько таких сборок слайдов параллельно. Когда агароза начнет застывать, переведите сборки на четыре градуса Цельсия. После 15 минут остывания срежьте излишки агарозы вокруг покровных стеблей.
Затем поместите сборки в чашки Петри и храните их при температуре четыре градуса Цельсия. После того, как чипсы инкубируются с бактериями, погружайте чипсы в ультрачистую воду по одной на 10 секунд каждая. Затем положите влажную стружку по краям на салфетку, пока большая часть жидкости не стечет.
Теперь удалите бактерии, которые не осели в лунках. Отрежьте кусочек ленты по длине силиконовой микросхемы и приклейте его к париленовой оболочке на силиконе. Затем отклейте ленту, чтобы удалить париленовую оболочку и сразу же приготовьтесь инвертировать сколотку.
Теперь поместите чип на ползунок так, чтобы микролунки соприкасались с агарозой. Будьте очень осторожны, чтобы не сдвинуть и не сместить чип после контакта с агарозой. Теперь перенесите всю сборку в держатель слайдов топовой камеры контроля окружающей среды и получайте покадровые изображения в течение следующих 24 часов с нужным интервалом и при 10-кратном увеличении.
Обрабатывайте стеки изображений с помощью обычного, свободно доступного программного обеспечения. Сначала импортируйте последовательность изображений. Для усреднения загрузите изображения коррекции или темного поля.
Затем выполните фоновое вычитание. Укажите значение радиуса, например 135 пикселей, и выберите скользящий параболоид. Затем удалите среднее изображение темного поля из изображения среднего поля освещенности, выбрав два изображения и используя операцию вычитания.
Теперь примените коррекцию освещенности следующим образом. Установите операцию на деление, установите i1 для изображения скважины, установите i2 для корректирующего изображения, установите k1 для среднего корректирующего изображения и установите k2 в ноль. Затем нажмите «Создать новое окно».
Чтобы количественно оценить рост бактерий в микролунках, сначала выберите интересующие области с помощью заглушки микрочипа. В меню карты нажмите кнопку Сбросить сетку и укажите строки, столбцы и диаметры скважин. Затем в меню формы ROI выберите круг.
Чтобы настроить массив ROI под изображение, массив ROI можно переместить, нажав клавишу ALT или ALT+SHIFT и выбрав верхний левый ROI с помощью мыши. Чтобы изменить размер ROI, нажмите клавишу Shift, выбрав правый нижний угол массива ROI. Чтобы настроить расстояние между ROI, нажмите клавишу Shift во время перетаскивания верхней или нижней стороны массива.
После того как массив ROI поместится по лункам изображения, нажмите кнопку Измерить RT. Затем будет выведена таблица со всеми измерениями для каждого изображения или временной точки, которую можно будет скопировать в электронную таблицу для анализа. Сравнивали рост двух штаммов Pseudomonas aeruginosa. Один штамм конститутивно экспрессирует токсичные эффекторные белки, связанные с секрецией шестого типа.
Другой подвержен патогенезу шестого типа из-за потери функции. Оба экспрессируют разный флуоресцентный белок. Кокультуры изучали в продольном направлении и в лунках разных размеров.
Бактерии культивировали по отдельности и в качестве совместной культуры. 20-часовой рост был визуализирован с 30-минутными интервалами. После проведения программной коррекции данных визуализации были построены количественные траектории роста.
В сокультуре данные не предполагают слишком больших изменений в росте. Чтобы продвинуть анализ, каждая траектория была подогнана к модифицированной логистической функции с тремя параметрами: максимальным сигналом, максимальной скоростью и временем задержки. Этот анализ позволяет предположить, что совместное выращивание этих видов оказало незначительное влияние на их общий рост, и их изменчивость, наблюдаемая на кривых роста, скорее всего, обусловлена факторами окружающей среды.
После освоения настройка может быть выполнена всего за несколько часов, если она выполнена правильно. При попытке выполнить эту процедуру важно иметь устойчиво растущие ячейки, чтобы правильно регулировать конечные значения внешнего диаметра ячейки, чтобы иметь однородные слои шнека в сборках чипов, и помнить об этом на этапе отделения от парилена. Следуя этой процедуре, такие вопросы, как изменение экспрессии генов в каждом сообществе в зависимости от состава и организации сообщества, могут быть решены с помощью анализа генетического материала.
Не забывайте, что работа с Pseudomonas aeruginosa может быть потенциально опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует использовать такие меры предосторожности, как перчатки, куртка, очки и надлежащие методы асептики.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Обзор
Этот протокол описывает метод высокопроизводительного анализа микробных сообществ в ограниченных средах с использованием массивов кремниевых микролунок. Он позволяет отслеживать микробные взаимодействия, значимые для различных областей, включая промышленность и медицину.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Микробная экология
- Биомедицинские исследования
- Экология
Бэкграунд
- Микробные сообщества зависят от взаимодействий членов сообщества и архитектуры окружающей среды.
- Понимание этих сообществ может дать представление об экологических и биомедицинских вопросах.
- Методы высокой пропускной способности необходимы для анализа сложных взаимодействий.
- Это исследование использует микроизготовленные среды для точного отслеживания.
Цель исследования
- Анализ многокомпонентных микробных сообществ в ограниченных пространствах.
- Исследование влияния пространственных ограничений на развитие сообщества.
- Исследование воздействия на изобилие и организацию микробных членов.
Использованные методы
- Приготовление массивов микролунок из кремниевых плит.
- Использование массивов с лунками диаметром от пяти до 100 микрон.
- Скрининг микробных взаимодействий в высокопроизводительном режиме.
- Параллельный анализ динамики сообществ в ограниченных средах.
Основные результаты
- Демонстрирует способность одновременно отслеживать тысячи микробных сообществ.
- Определяет ключевые взаимодействия, зависящие от размера ниши и ограничений.
- Предоставляет представление о детерминированных и стохастических параметрах развития сообществ.
- Подчеркивает значимость этого метода для промышленности и экологических приложений.
Выводы
- Этот метод предлагает новый подход к изучению микробных взаимодействий.
- Он улучшает понимание динамики сообществ в ограниченных средах.
- Будущие исследования могут опираться на эти результаты для решения экологических и биомедицинских задач.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
This microwell array platform enables high-throughput parallel analysis of microbial community development in confined environments, supporting mechanistic de-risking in early discovery by quantifying spatial and interaction effects on microbial growth. The method provides predictive confidence in target validation by revealing how fine-scale spatial constraints influence deterministic and stochastic parameters of community dynamics, directly informing translational biomarker and preclinical model relevance. Its scalability and reproducibility support enterprise R&D workflows in antimicrobial target screening and phenotypic screening applications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by quantifying how spatial confinement alters microbial member abundance and organization in co-culture systems.
- Operational Value: Enables functional target validation through longitudinal tracking of fluorescently labeled strains in defined microwell environments.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by measuring growth trajectories and interaction effects under controlled niche sizes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by standardizing microbial seeding in arrays with well diameters from 5 to 100 microns.
- Operational Value: Ensures assay reproducibility through BSA passivation, controlled incubation, and agarose-coated imaging substrates that minimize evaporation and drift.
- Scalability Value: Enables parallel analysis of thousands of communities, supporting platform reuse across antimicrobial and pathogenicity studies.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Connects discovery-phase interaction data to preclinical continuity by modeling how spatial constraints affect pathogenic outcomes in Pseudomonas aeruginosa co-cultures.
- Mechanistic De-risking: Quantifies negligible growth effects in co-culture, helping de-risk false positives in target validation screens.
- Predictive Confidence: Uses modified logistic fitting of growth curves to extract maximum signal, rate, and lag time for comparative strain analysis.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from hypothesis testing to lead identification, providing quantitative interaction data that informs go/no-go decisions in antimicrobial target programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by revealing how spatial constraints drive community development parameters in multi-member systems.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized chip preparation, bacterial adhesion at 4°C, and time-lapse fluorescence imaging at 30-minute intervals over 20 hours.
- Analytics: Generates quantitative growth trajectories via background subtraction, illumination correction, and ROI-based fluorescence measurement, enabling statistical comparison of conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical relevance by modeling Type VI secretion-dependent interactions in Pseudomonas aeruginosa, a pathogen with biomedical significance.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for screening microbial interactions across industry, medicine, and environmental applications due to its parallel throughput and confined-environment precision.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through quantification of microbial interaction effects in spatially constrained environments.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via controlled chip preparation, fluorescence labeling, and automated image analysis workflows.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by de-risking mechanistic ambiguity in early-stage antimicrobial target identification.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on quantitative interaction data from high-throughput community arrays.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microbiology, fluorescence microscopy, and image analysis software for ROI setup and quantitative measurement.
- Depends on silicon microfabrication infrastructure, agarose-coated slide assemblies, and environmental control chambers for stable 24-hour imaging.
- Necessitates cross-team standardization of bacterial preparation, OD adjustment, and parylene removal steps to ensure well-specific adhesion.
- Requires adaptation considerations when extending beyond Pseudomonas aeruginosa to other microbial models due to surface chemistry and growth variability.
- Practical limitations include the need for aseptic technique when handling Pseudomonas aeruginosa and potential well-to-well variability in sub-10 micron features.
