Сборка и отслеживание развития микробного сообщества в рамках платформы массивов микролистов
6 июня 2017 г.
Развитие микробных сообществ зависит от сочетания факторов, включая экологическую архитектуру, численность членов, черты и взаимодействия. В этом протоколе описывается синтетическая микроструктурированная среда для одновременного отслеживания тысяч сообществ, содержащихся в ямах фемтолитера, где могут быть аппроксимированы ключевые факторы, такие как размер ниши и ограничение.
Общей целью этого метода является высокопроизводительный параллельный анализ многочленных микробных сообществ в замкнутых средах с использованием кремниевых микролуночных массивов. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он обеспечивает высокопроизводительный высокопараллельный скрининг тонко локализованных микробных взаимодействий, которые важны для промышленности, медицины и окружающей среды. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биомедицины и экологии микроорганизмов, такие как как пространственные ограничения, присущие мелким масштабам, влияют на детерминированные и стохастические параметры развития сообществ и каково их ключевое влияние на численность и организацию микробных членов?
Начните с подготовки массивов микролунок. Во-первых, вырежьте отдельные микролуночные чипы из кремниевых пластин, напечатанных с помощью нескольких массивов, с помощью алмазного начертателя. Каждый отдельный чип содержит подмассивы лунок диаметром от пяти до 100 микрон с тремя различными плотностями расстояния.
На каждой стружке полный мотив лунок также повторяется четыре раза. Затем сделайте увлажненную камеру с помощью коробки для наконечника для пипетки и пропитанной салфеткой PBS. Затем нанесите на каждую чипсу каплю раствора БСА объемом 150 микролитров и выдержите чипсы в коробке в течение часа при комнатной температуре.
Тем временем подготовьте бактерии. Уменьшите культуру и повторно суспендируйте ее в 500 микролитрах свежей среды R2A с двухпроцентным глицерином. Затем измерьте плотность культуры на уровне 600 нанометров и отрегулируйте концентрацию до оптической плотности 0,02.
После инкубации чипсов удалите раствор БСА и трижды промойте чипсы PBS. После промываний просушите стружку газообразным азотом и верните в увлажненную камеру. Далее добавьте в каждую сухую стружку по 150 микролитров суспензии культуры и инкубируйте чипсы в течение часа при четырех градусах Цельсия, чтобы бактерии успели прилипнуть к лункам, но деление клеток любого возможного загрязнения происходит медленно.
Чтобы подготовить чип к визуализации, сначала сделайте покровный лист с агарозным покрытием для каждого чипа. Разжижают небольшой объем агарозы, на каждый покровный лист нужно около пяти миллилитров. Затем промойте одну сторону чехлового стекла этанолом и центрируйте его на предметном стекле вымытой стороной вверх.
Затем расположите две прокладки PDMS толщиной в один миллиметр вдоль длинных краев защитного стекла и сдвиньте защитное стекло так, чтобы один миллиметр свисал с затвора. Теперь налейте на покровную крышку достаточное количество агарозы, чтобы полностью покрыть ее. Затем с помощью второго предметного стекла разровняйте агарозу до равномерной толщины.
Подготовьте несколько таких сборок слайдов параллельно. Когда агароза начнет застывать, переведите сборки на четыре градуса Цельсия. После 15 минут остывания срежьте излишки агарозы вокруг покровных стеблей.
Затем поместите сборки в чашки Петри и храните их при температуре четыре градуса Цельсия. После того, как чипсы инкубируются с бактериями, погружайте чипсы в ультрачистую воду по одной на 10 секунд каждая. Затем положите влажную стружку по краям на салфетку, пока большая часть жидкости не стечет.
Теперь удалите бактерии, которые не осели в лунках. Отрежьте кусочек ленты по длине силиконовой микросхемы и приклейте его к париленовой оболочке на силиконе. Затем отклейте ленту, чтобы удалить париленовую оболочку и сразу же приготовьтесь инвертировать сколотку.
Теперь поместите чип на ползунок так, чтобы микролунки соприкасались с агарозой. Будьте очень осторожны, чтобы не сдвинуть и не сместить чип после контакта с агарозой. Теперь перенесите всю сборку в держатель слайдов топовой камеры контроля окружающей среды и получайте покадровые изображения в течение следующих 24 часов с нужным интервалом и при 10-кратном увеличении.
Обрабатывайте стеки изображений с помощью обычного, свободно доступного программного обеспечения. Сначала импортируйте последовательность изображений. Для усреднения загрузите изображения коррекции или темного поля.
Затем выполните фоновое вычитание. Укажите значение радиуса, например 135 пикселей, и выберите скользящий параболоид. Затем удалите среднее изображение темного поля из изображения среднего поля освещенности, выбрав два изображения и используя операцию вычитания.
Теперь примените коррекцию освещенности следующим образом. Установите операцию на деление, установите i1 для изображения скважины, установите i2 для корректирующего изображения, установите k1 для среднего корректирующего изображения и установите k2 в ноль. Затем нажмите «Создать новое окно».
Чтобы количественно оценить рост бактерий в микролунках, сначала выберите интересующие области с помощью заглушки микрочипа. В меню карты нажмите кнопку Сбросить сетку и укажите строки, столбцы и диаметры скважин. Затем в меню формы ROI выберите круг.
Чтобы настроить массив ROI под изображение, массив ROI можно переместить, нажав клавишу ALT или ALT+SHIFT и выбрав верхний левый ROI с помощью мыши. Чтобы изменить размер ROI, нажмите клавишу Shift, выбрав правый нижний угол массива ROI. Чтобы настроить расстояние между ROI, нажмите клавишу Shift во время перетаскивания верхней или нижней стороны массива.
После того как массив ROI поместится по лункам изображения, нажмите кнопку Измерить RT. Затем будет выведена таблица со всеми измерениями для каждого изображения или временной точки, которую можно будет скопировать в электронную таблицу для анализа. Сравнивали рост двух штаммов Pseudomonas aeruginosa. Один штамм конститутивно экспрессирует токсичные эффекторные белки, связанные с секрецией шестого типа.
Другой подвержен патогенезу шестого типа из-за потери функции. Оба экспрессируют разный флуоресцентный белок. Кокультуры изучали в продольном направлении и в лунках разных размеров.
Бактерии культивировали по отдельности и в качестве совместной культуры. 20-часовой рост был визуализирован с 30-минутными интервалами. После проведения программной коррекции данных визуализации были построены количественные траектории роста.
В сокультуре данные не предполагают слишком больших изменений в росте. Чтобы продвинуть анализ, каждая траектория была подогнана к модифицированной логистической функции с тремя параметрами: максимальным сигналом, максимальной скоростью и временем задержки. Этот анализ позволяет предположить, что совместное выращивание этих видов оказало незначительное влияние на их общий рост, и их изменчивость, наблюдаемая на кривых роста, скорее всего, обусловлена факторами окружающей среды.
После освоения настройка может быть выполнена всего за несколько часов, если она выполнена правильно. При попытке выполнить эту процедуру важно иметь устойчиво растущие ячейки, чтобы правильно регулировать конечные значения внешнего диаметра ячейки, чтобы иметь однородные слои шнека в сборках чипов, и помнить об этом на этапе отделения от парилена. Следуя этой процедуре, такие вопросы, как изменение экспрессии генов в каждом сообществе в зависимости от состава и организации сообщества, могут быть решены с помощью анализа генетического материала.
Не забывайте, что работа с Pseudomonas aeruginosa может быть потенциально опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует использовать такие меры предосторожности, как перчатки, куртка, очки и надлежащие методы асептики.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе описывается метод высокопроизводительного анализа микробных сообществ в замкнутых средах с использованием массивов кремниевых микролунок. Этот метод позволяет отслеживать микробные взаимодействия, имеющие значение для различных областей, включая промышленность и медицину.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Микробная экология
- Биомедицинские исследования
- Экология
Теоретическая часть
- Микробные сообщества находятся под влиянием архитектуры окружающей среды и взаимодействий между их членами.
- Изучение этих сообществ может дать ответы на важные экологические и биомедицинские вопросы.
- Высокопроизводительные методы имеют важное значение для анализа сложных взаимодействий.
- В данном исследовании используются микроизготовленные среды для точного отслеживания.
Цель исследования
- Для анализа многокомпонентных микробных сообществ в ограниченном пространстве.
- Для изучения влияния пространственных ограничений на развитие сообщества.
- Для исследования эффектов, влияющих на численность и организацию членов микробного сообщества.
Используемые методы
- Приготовление массивов микролунок из кремниевых пластин.
- Использование массивов с лунками размером от 5 до 100 микрон.
- Высокопроизводительный скрининг микробных взаимодействий.
- Параллельный анализ динамики сообществ в ограниченных средах.
Основные результаты
- Продемонстрирована возможность одновременного отслеживания тысяч микробных сообществ.
- Выявлены ключевые взаимодействия, на которые влияют размер ниши и ограниченность пространства.
- Получены сведения о детерминированных и стохастических параметрах развития сообщества.
- Подчеркнута значимость данного метода для промышленного применения и экологических исследований.
Выводы
- Данный метод предлагает новый подход к изучению микробных взаимодействий.
- Он расширяет понимание динамики сообществ в ограниченных средах.
- Будущие исследования могут опираться на эти результаты для решения экологических и биомедицинских задач.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Данная платформа на базе массива микролунок обеспечивает высокопроизводительный параллельный анализ развития микробных сообществ в ограниченном пространстве, что способствует снижению рисков на ранних этапах поиска путем количественной оценки влияния пространственных факторов и взаимодействий на рост микроорганизмов. Метод обеспечивает прогностическую достоверность при валидации мишеней, раскрывая, как мелкомасштабные пространственные ограничения влияют на детерминированные и стохастические параметры динамики сообщества, что напрямую определяет значимость трансляционных биомаркеров и доклинических моделей. Масштабируемость и воспроизводимость данной платформы поддерживают рабочие процессы корпоративных R&D-подразделений при скрининге антимикробных мишеней и в приложениях для фенотипического скрининга.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: Позволяет проверить терапевтические гипотезы путем количественной оценки того, как пространственное ограничение изменяет численность и организацию микробных компонентов в системах совместного культивирования.
- Практическая ценность: Обеспечивает валидацию функциональных мишеней посредством продольного отслеживания флуоресцентно меченных штаммов в определенной среде микролунок.
- Прогностическая ценность: Поддерживает приоритизацию портфеля препаратов путем измерения траекторий роста и эффектов взаимодействия при контролируемых размерах ниши.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Подготовка валидированных биологических систем для последующего скрининга путем стандартизации посева микроорганизмов в массивах с диаметром лунок от 5 до 100 микрон.
- Практическая ценность: Обеспечение воспроизводимости анализа за счет пассивации BSA, контролируемой инкубации и использования подложек для визуализации с агарозным покрытием, которые сводят к минимуму испарение и дрейф.
- Ценность масштабируемости: Обеспечение возможности параллельного анализа тысяч сообществ, что позволяет повторно использовать платформу в исследованиях антимикробных свойств и патогенности.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная значимость: обеспечивает связь между данными о взаимодействиях на этапе открытия и доклинической преемственностью путем моделирования влияния пространственных ограничений на патогенные исходы в кокультурах Pseudomonas aeruginosa.
- Механистическое снижение рисков: количественно определяет незначительные эффекты роста в кокультуре, что помогает снизить вероятность ложноположительных результатов при скрининге для валидации мишеней.
- Прогностическая достоверность: использует модифицированную логистическую аппроксимацию кривых роста для извлечения максимального сигнала, скорости и времени лага при сравнительном анализе штаммов.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Данный метод вписывается в континуум открытий — от проверки гипотез до идентификации перспективных соединений-лидеров, предоставляя количественные данные о взаимодействиях, которые позволяют принимать решения о продолжении или прекращении работы в программах по поиску антимикробных мишеней.
- Открывательная биология: способствует проверке гипотез, выявляя, как пространственные ограничения определяют параметры развития сообщества в многокомпонентных системах.
- Скрининг: обеспечивает готовность анализа за счет стандартизированного приготовления чипов, адгезии бактерий при 4°C и таймлапс-флуоресцентной визуализации с 30-минутным интервалом в течение 20 часов.
- Аналитика: позволяет получать количественные траектории роста путем вычитания фона, коррекции освещения и измерения флуоресценции в выбранных областях интереса (ROI), что делает возможным статистическое сравнение условий.
- Трансляционные исследования: имеют доклиническую значимость благодаря моделированию взаимодействий, зависящих от секреции VI типа, у Pseudomonas aeruginosa — патогена, имеющего биомедицинское значение.
- Корпоративное использование: служит универсальной платформой для скрининга микробных взаимодействий в промышленности, медицине и экологических приложениях благодаря параллельной пропускной способности и точности в ограниченной среде.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Прогностическая уверенность в валидации мишени за счет количественной оценки эффектов микробного взаимодействия в пространственно ограниченных средах.
- Практическая ценность: Стандартизация и воспроизводимость за счет контролируемой подготовки чипов, флуоресцентного мечения и автоматизированных рабочих процессов анализа изображений.
- Стратегическая ценность: Оптимизация принятия решений о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go) путем снижения рисков, связанных с механистической неопределенностью при идентификации мишеней антимикробных препаратов на ранних стадиях.
- Влияние на портфель: Приоритизация с учетом рисков на основе количественных данных о взаимодействиях, полученных из высокопроизводительных массивов сообществ.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области микробиологии, флуоресцентной микроскопии и использовании программного обеспечения для анализа изображений для настройки областей интереса (ROI) и проведения количественных измерений.
- Процесс зависит от инфраструктуры микропроизводства кремниевых структур, использования предметных стекол с агарозным покрытием и камер с контролем окружающей среды для стабильной визуализации в течение 24 часов.
- Необходима межгрупповая стандартизация этапов подготовки бактерий, корректировки оптической плотности (OD) и удаления парилена для обеспечения специфической адгезии в лунках.
- При расширении области исследования за пределы Pseudomonas aeruginosa на другие микробные модели требуются адаптационные меры в связи с различиями в химии поверхности и вариабельностью роста.
- Практические ограничения включают необходимость соблюдения правил асептики при работе с Pseudomonas aeruginosa, а также возможную вариабельность структур размером менее 10 микрон от лунки к лунке.
