Определение конкуренции на олигопептидах для определения местонахождения фосфорилирования

Общая цель этой процедуры заключается в одновременной оценке нескольких потенциальных сайтов фосфорилирования и выявлении сайтов для последующей валидации мутантами сайта фосфорилирования. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биохимии и клеточной биологии о роли посттрансляционных модификаций в клеточной сигнализации. Этот метод позволяет легко и недорого провести предварительный скрининг сайтов фосфорилирования и интересующего белка.

Применение этого метода распространяется на диагностику и терапию заболеваний, включая воспаление и рак, поскольку фосфорилирование является важным биохимическим событием в сигнальных путях при заболеваниях человека. Помогать в демонстрации будет Сол-Би Шин, аспирант из моей лаборатории, который во время выполнения сайт-направленного мутагенеза. Сначала соедините 50 нанограмм плазмы pGEX JST NRF2, 125 нанограмм прямого праймера, 125 нанограмм обратного праймера, один микролитр смеси DNTP, 2,5 единицы PFU ДНК-полимеразы и 10x реакционный буфер на льду.

Добавьте стерильную дистиллированную воду, чтобы довести объем до 50 микролитров. Проведите ПЦР, чтобы включить мутантную цепь, а затем охладите образец на льду в течение двух минут. Добавьте в охлажденный образец один микролитр фермента рестрикции ДПНИ.

Смешайте образец с помощью щадящего пипетирования, а затем центрифугируйте образец в течение одной минуты при температуре 13 000 °G. Инкубируйте образец при температуре 37 градусов Цельсия в течение двух часов, чтобы переварить родительскую двухцепочечную ДНК. Затем бросьте на лед сверхкомпетентные клетки E.coli с мутациями endA1 и RACA1. Добавьте 50 микролитров реакционной смеси к охлажденным клеткам и инкубируйте на льду в течение 30 минут.

Тем временем разогрейте нагревательный блок до 42 градусов Цельсия. После завершения инкубации нагрейте смесь до 42 градусов Цельсия в течение 90 секунд, а затем охладите смесь на льду в течение двух минут. Добавьте к трансформированным клеткам предварительно подогретый отвар лизогении.

Инкубируйте смесь при температуре 37 градусов Цельсия в течение часа, встряхивая при 180 об/мин. Затем распределите клетки на пластинах с ампициллиновым агаром LB и инкубируйте пластины в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия. Переложите на одну колонию до пяти миллилитров отвара лизогении с ампициллином.

Инкубируйте образцы в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия и встряхивайте со скоростью 180 об/мин. Извлеките образец ДНК с помощью стандартного мини-набора для анализа последовательности ДНК. Пропустите не менее 200 нанограммов конструкции HDNA в анализаторе ДНК, чтобы проверить мутантную последовательность.

Экспрессируйте и очищайте валидированный мутантный белок NRF2. Определите количество продуцируемого мутированного NRF2 перед проведением киназного анализа. Чтобы начать анализ пептидной конкуренции, приготовьте буферный раствор 5Х киназы с концентрацией аденозинмонофосфата 500 микромоляров.

Затем разморозьте замороженные образцы AMPK дикого типа человеческого NRF2 и трех олиогопептидов, имитирующих сайты фосфорилирования NRF2 AMPK. Для каждого пептида, находясь на льду, смешайте 0,43 миллиграмма пептида с 0,15 микрограмма AMPK, 0,4 микрограмма NRF2 и шестью микролитрами 5X киназного буфера. Добавьте стерильную дистиллированную воду для достижения конечного объема в 30 микролитров.

Затем в экранированном помещении установите нагревательный блок на 30 градусов Цельсия. Добавьте по одному микрокюри гамма-32P АТФ в каждую пробирку, тщательно перемешивая каждый раствор пипетированием вверх и вниз. Инкубируйте реакционные смеси при температуре 30 градусов Цельсия в течение 15–30 минут.

Во время инкубации приготовьте гель 7,5%STS PAGE. Затем добавьте три микролитра 10-кратного буфера для образцов STS в каждую пробирку и тщательно перемешайте, чтобы остановить киназную реакцию. Запустите образцы в геле при напряжении 70 вольт в течение 20 минут, а затем при 140 вольт в течение одного часа.

По завершении электрофореза гелем осторожно удалите высокорадиоактивный гель ниже синей линии бромофенола. Аккуратно переложите гель с ролика на стеклянную трубку. Закрепите гель в растворе 50% метанола, 40% воды и 10% уксусной кислоты на 20 минут.

Затем аккуратно выложите гель на фильтровальную бумагу и накройте прозрачной пленкой. Высушите гель в вакуумной сушилке для геля в течение часа при температуре 80 градусов Цельсия. Воздействие на сухой гель либо на фосфорный экран, либо на рентгеновскую пленку в течение примерно 16 часов в течение двух дней соответственно.

Используйте Phosphorimager для создания файла экрана в формате TIFF или Bitmap с высоким разрешением. Для начала анализа активности АМФК размораживают образцы АМФК и мутантного и дикого типа GST NRF2 на льду. Смешайте 0,4 микрограмма мутантного GST NRF2 с 0,15 микрограмма AMPK и шестью микролитрами буфера 5X Kinase.

Добавьте стерильную дистиллированную воду, чтобы довести объем до 30 микролитров. Приготовьте таким образом еще одну реакционную смесь с 0,4 мкг дикого типа GST NRF2. Добавьте по одному микрокюри гамма-32P АТФ в каждый реакционный флакон.

Несколько раз пипетируйте смеси вверх и вниз, а затем кратковременно центрифугируйте смеси. Инкубируйте смеси при температуре 30 градусов Цельсия в течение 30 минут в экранированной зоне, а затем завершите киназную реакцию тремя микролитрами 10-кратного буфера для образцов STS. Запустите STS PAGE, закрепите гель и высушите гель, используя те же условия, что и при конкурентном анализе киназы.

Поместите гель на экран с фосфором на ночь и отсканируйте экран с помощью Phosphorimager. Анализ AMPK in vitro проводили в присутствии трех 10 олигопептидов с 10 остатками, имитирующих сайты фосфорилирования AMPK на NRF2 человека. Олигопептид, имитирующий сайт Serine 558, представлял наибольшую конкуренцию фосфорилированию AMPK.

Затем был синтезирован мутант NRF2, заменяющий серин 558 на аланин, который был оценен в анализе активности in vitro. Наблюдалось очень слабое фосфорилирование AMPK мутанта S558 A, что указывает на то, что AMPK непосредственно фосфорилирует человеческий NRF2 на серине 558. Поскольку пептиды конкурентно связываются с белками, принцип этого метода может быть также применен для идентификации других посттрансляционных и модифицированных веществ, таких как ацетилизация и остатки лизина, а также белковые белковые взаимодействия.

Не забывайте, что работа с радиоизотопами может быть крайне опасной. Перед выполнением этой процедуры уже следует пройти обучение по безопасности радиоизотопов.