Морфометрические и клеточного анализа метод для мышиных нижней челюсти мыщелка

Общая цель данного эксперимента — наблюдение за эффектами компрессионной нагрузки в хряще мыщелка нижней челюсти мышей с помощью морфометрических измерений на рентгенограммах и гистологического анализа. Эти показатели могут помочь ответить на ключевые вопросы, касающиеся структурных и клеточных изменений в мыщелке нижней челюсти грызунов. Основным преимуществом представленного метода является возможность его применения для анализа других мелких костных или партисипированных животных.

Для данного протокола необходимо подготовить изолированные препарированные нижние челюсти мыши. Поместите челюсти в чашку Петри и перенесите их в систему рентгеновского кабинета. Затем сделайте рентгенограммы при напряжении 26 kilovolts в течение пяти секунд.

Теперь откройте изображения в программе для анализа, чтобы провести морфометрические измерения. Сначала используйте кнопку единиц измерения для настройки масштабной линейки. Затем выберите шесть анатомических точек, используя стиль маркера 2.

Сначала выберите самые задние точки мыщелка нижней челюсти в качестве точки один. Затем выберите резцовый отросток в качестве точки два. После этого выберите самую глубокую точку сигмовидной вырезки в качестве точки три.

Затем выберите самую глубокую точку вогнутости ветви нижней челюсти — точка четыре, после чего выберите самую переднюю точку суставной поверхности мыщелка — точка пять. Теперь выберите самую заднюю точку суставной поверхности мыщелка в качестве точки шесть и перейдите к измерению длины с помощью инструмента измерения длины. Далее с помощью инструмента построения перпендикуляра проведите линию от точки три к точке четыре, чтобы измерить длину головки мыщелка, которая представляет собой длину перпендикуляра от точки один до линии, соединяющей точки три и четыре.

Затем измерьте длину нижней челюсти между точками один и два. В завершение измерьте ширину головки мыщелка между точками пять и шесть. Чтобы сохранить данные, скопируйте список измерений в правой части экрана.

Перед заливкой фиксированных, но не декальцинированных нижних челюстей выдержите их в течение ночи в 30% растворе сахарозы в PBS. На следующий день удалите излишки мягких тканей и аккуратно вырежьте мыщелок нижней челюсти. Затем поместите образцы в пластиковые формы так, чтобы медиальная поверхность мыщелка прилегала к основанию формы, а сам образец располагался параллельно дну формы.

Затем погрузите их в эпоксидную смолу для заливки и охладите смолу с помощью кусочка сухого льда. После этого долейте в формы смолу до верха. Перенесите их в холодный 2-метилбутан, охлажденный в морозильной камере или сухим льдом.

После охлаждения храните образцы при температуре -20 °C или -80 °C до момента изготовления срезов. Для количественного определения экспрессии Col10a1 в MCC сагиттальных срезов мыщелков откройте гистологические изображения в программном пакете для анализа изображений и выделите область интереса с помощью инструмента «лассо». В данном случае выделяется область MCC.

Обратите внимание на количество пикселей в области, которое указано в окне гистограммы. Затем выберите красные пиксели Col10a1, настроив цветовой диапазон. Используйте инструмент «пипетка», чтобы выбрать красный пиксель на изображении, и нажмите OK. После этого запишите количество красных пикселей в области, указанное в окне гистограммы.

Доля красных пикселей в области представляет собой уровень экспрессии Col10a1. Теперь, используя ту же базовую методику, количественно определите активность TRAP в MCC и субхондральной кости. Сначала выберите хрящ в областях субхондральной кости в качестве зон анализа и зафиксируйте общее количество пикселей.

Затем выберите желтые пиксели, образовавшиеся в результате воздействия субстрата ELF97. Зафиксируйте количество положительных пикселей и рассчитайте долю TRAP-положительных пикселей. Теперь количественно определите EDU-положительные клетки, окрашенные в синий цвет с помощью DEPI.

Снова выберите область интереса, а затем количественно определите количество синих пикселей в ней. Также используйте этот метод для определения количества EdU-положительных пикселей в той же области. Морфометрические измерения мышей, подвергнутых компрессионной нагрузке на ВНЧС, показали, что нагрузка значительно увеличила длину нижней челюсти и головки мыщелка.

Тем не менее, нагрузка не привела к значимому изменению ширины мыщелка. Количественный анализ распределения коллагена выявил значительное повышение экспрессии Col10a1 и MCC в мыщелках животных, подвергшихся нагрузке. С другой стороны, экспрессия Col2a1 существенно не отличалась от контрольной группы.

Активность TRAP повысилась в субхондральной области мыщелков и у мышей с нагрузкой, так же как и субпролиферация. Окрашивание EDU указывает на количество пролиферирующих клеток. Распределение протеогликанов в MCC было количественно определено путем оценки площади, окрашенной толуидиновым синим, и карты расстояний.

В группе с нагрузкой наблюдалось значительное увеличение расстояния картирования в MCC мыщелков. Однако площадь окрашивания протеогликанов статистически не различалась между группами. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как анализировать клеточные и структурные изменения в мыщелке нижней челюсти грызунов.