Визуализация хондроцитов интеркаляции и направленного распространения через Zebrabow клонального анализа клеточной хряща в эмбриональном Меккеля

Общая цель следующего эксперимента заключается в визуализации взаиморасположения и вытянутости хондроцитов с помощью клонального анализа клеток методом zebra bow. Для этого создается линия мышей zebra bow M с трансгеном SOX 10 ERT2 Cre для обеспечения тканеспецифичной рекомбинации в черепно-лицевом хряще эмбрионов с целью последующего клонального анализа. Затем эмбрионы на стадии 10 сомитов подвергаются кратковременному воздействию тамоксифена в течение трех часов для индукции процесса рекомбинации.

Затем отбирают эмбрионы с экспрессией активности CRE и сильной красной флуоресценцией или экспрессией RFP, и эти эмбрионы монтируют для визуализации черепно-лицевого хряща C. Результаты демонстрируют мультиспектральный анализ клеток хондроцитов черепно-лицевой области на основе конфокальной микроскопии. Основное преимущество данного метода перед существующими способами, такими как окрашивание S синим цветом или использование трансгенных линий, таких как so и GFP или SOX и kde, заключается в том, что zebra bow позволяет специфически наблюдать за клональными популяциями клеток, участвующими в формировании органа, и отслеживать их.

Для подготовки к сбору эмбрионов в первый день, в период с 17:00 до 18:00 рассадите несколько пар самцов и самок трансгенных данио-рерио соx, 10 ERT two Cree zebra bow M в разделительные нерестовые аквариумы. На следующий день, предварительно убедившись под световым микроскопом, что эмбрионы достигли 10-клеточной стадии, осмотрите их под флуоресцентным микроскопом с RFP-фильтром. Изолируйте ярко-красные эмбрионы и перенесите их в новую чашку Петри со свежей средой E3 для индукции рекомбинации Cree. Добавьте в чашку Петри 10 µM раствор гидрокситамоксифена и инкубируйте эмбрионы при температуре 28.5 °C в течение трех часов.

Затем слейте раствор тамоксифена в контейнер для биологических отходов и несколько раз промойте эмбрионы раствором E3. После инкубации эмбрионов в течение ночи до стадии 28–29 сомитов перенесите их в раствор E3 с PTU и верните в инкубатор. Для визуализации полностью развитых краниофациальных структур выберите эмбрионы на 4-й день после оплодотворения (DPF) с интенсивным красным сигналом и экспрессией yellow Cree в сетчатке. После анестезии эмбриона в трикаине согласно текстовому протоколу перенесите его в чашку Петри с каплей метилцеллюлозы на чистый предметное стекло для конфокальной микроскопии.

Поместите каплю свежего метилцеллюлозного раствора и с помощью наконечника микрозагрузчика зафиксируйте эмбрион в дорсальном положении, стараясь не касаться его напрямую, затем накройте покровным стеклом размером 25 на 25. Накройте эмбрион и при необходимости используйте покровное стекло для его перемещения. Для получения изображений эмбриона используйте сухой объектив с увеличением 20x.

Чтобы сфокусироваться на объекте, нажмите кнопку L 100 на микроскопе, затем выберите кнопку настроек конфокального режима. Нажмите «auto» и выберите CFP для первого канала, GFP для второго канала и RFP или M cherry для третьего канала. Затем закройте окно.

Включите второй и третий каналы, прежде чем нажать кнопку снятия блокировки (remove interlock). Затем нажмите кнопку воспроизведения (play), чтобы начать сканирование. После настройки параметров сделайте необходимые снимки и сохраните их как в формате программного обеспечения конфокального микроскопа, так и в формате TIF для последующей обработки изображений по каналам.

Для проведения CFP-визуализации выключите второй и третий каналы и включите первый канал, не изменяя область фокусировки. Перед захватом изображений заново настройте параметры сканирования, сохраните изображения описанным выше способом и проведите обработку изображений согласно методу, описанному Pan и коллегами, как показано здесь. Традиционная визуализация хряща путем окрашивания всего препарата синим синином (Alcian blue) неоценима для наблюдения за развивающимся хрящом Меккеля и обычно используется для визуализации окончательной клеточной организации с целью дальнейшего анализа развития хондроцитов во времени с помощью отслеживания клеточных линий.

Трансгенные линии SOX 10 kda использовались для изучения миграции, конвергенции и экстенсии клеток в живых эмбрионах с помощью прижизненной визуализации трансгенной линии zebra bow m. Дальнейшее изучение организации хондроцитов в краниофациальной скелетной структуре C выявило процесс интеркаляции и удлинения хондроцитов, который опосредует экстензию и рост хряща Меккеля. На данном рисунке представлена нижняя челюсть трансгенных эмбрионов zebra bow M Sox 10 ERT two Cree в период от 3D PF до пяти дней после оплодотворения.

Нижнюю челюсть лучше всего фотографировать со стороны брюшной поверхности, чтобы обеспечить четкий обзор организации клеток в хряще Meckel, как показано здесь. Стабильно сохраняемые и наследуемые цвета позволяют легко отслеживать линии развития и картировать судьбу клеток краниального нервного гребня. Видно, как единственная синяя клетка мигрирует и встраивается между соседними клетками, затем удлиняется вдоль передне-задней оси, формируя однородный участок хряща, тем самым поддерживая общую форму хряща Meckel по мере его распространения вперед.

Данный метод открывает перед исследователями в области развития хрящевой ткани возможность изучения хондроцитов при формировании скелета у zebrafish.