Визуализация хондроцитов интеркаляции и направленного распространения через Zebrabow клонального анализа клеточной хряща в эмбриональном Меккеля

Общая цель данного эксперимента заключается в визуализации взаимного сопоставления и удлинения хондроцитов с помощью анализа клональных клеток лука зебры. Это достигается за счет создания SOX 10 ERT two Cree zebra bow M линии для достижения тканеспецифической рекомбинации в черепном лицевом хряще и эмбрионах для клонального анализа. Далее эмбрионы подвергаются импульсной обработке тамоксифеном на 10-й стадии, так клеща в течение трех часов, чтобы вызвать процесс рекомбинации.

Затем эмбрионы отбирают по экспрессии активности CRE и сильной экспрессии красного флуоресцента или RFP, а эмбрионы монтируют для визуализации черепно-лицевого хряща C. Результаты представляют собой мультиспектральный клеточный анализ черепно-лицевых хондроцитов на основе конфокальной визуализации. Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как S в синем цвете или трансгенными линиями, такими как so и GFP или SOX и kde, заключается в том, что лук зебры позволяет нам целенаправленно наблюдать и следить за клональными клеточными популяциями, участвующими в формировании органа.

Чтобы подготовиться к сбору эмбрионов в первый день, поместите несколько пар самцов и самок сок, 10 ERT двух трансгенных рыб зебры кри лук М в разделенных брачных резервуарах между пятью и 6:00 вечера на следующий день после проверки под световым микроскопом, что эмбрионы достигли 10 стадии целлюлита под флуоресцентным микроскопом с фильтром RFP. Изолируйте ярко-красные эмбрионы и перенесите их в новую чашку Петри со свежей средой Е-3, чтобы вызвать рекомбинацию кри. Добавьте в чашку Петри 10 микромолярного раствора гидрокси тамоксифена и инкубируйте эмбрионы при температуре 28,5 градусов Цельсия в течение трех часов.

Затем сцедите раствор тамоксифена в контейнер для биологических отходов и с помощью Е три промывают эмбрионы несколько раз после инкубации эмбрионов в течение ночи до 28-29 часов, затем переложите эмбрионы в раствор Е три ПТУ и верните их в инкубатор. Чтобы визуализировать полностью развитые черепно-лицевые структуры C, выберите эмбрионы на четырех DPF с интенсивным красным сигналом и желтой экспрессией кри в сетчатке. После обезболивания эмбриона в Trica, согласно текстовому протоколу, перенесите его в чашку Петри, содержащую каплю метилцеллюлозы, на чистом конфокальном предметном стекле.

Поместите каплю свежей метилцеллюлозы и с помощью наконечника микрозагрузчика установите эмбрион в дорсальном положении, стараясь при этом не касаться его напрямую защитным накладочным листом 25 на 25. Накройте эмбрион и при необходимости используйте защитный лист для манипуляций с эмбрионом. Чтобы получить изображение эмбриона, используйте объектив с 20-кратным увеличением длины линзы.

Чтобы сфокусироваться на объекте, нажмите кнопку L 100 на микроскопе, затем выберите кнопку настройки конфокального фокуса. Нажмите «Авто» и выберите CFP для первого канала, GFP для второго канала и RFP или M cherry для третьего канала. Затем закройте окно.

Включите второй и третий каналы перед нажатием кнопки удаления блокировки. Затем нажмите кнопку воспроизведения, чтобы начать сканирование. После корректировки настроек захватите нужные снимки и сохраните их в формате конфокального программного обеспечения, а также в формате TIF для обработки изображений по каналам.

Чтобы выполнить съемку CFP, выключите второй и третий каналы и включите первый канал, не меняя зону фокусировки. Отрегулируйте параметры сканирования перед захватом изображений, сохраните изображения в соответствии с описанием и выполните обработку изображений, как описано pan и его коллегами, как показано здесь. Традиционная визуализация хряща с помощью окрашивания всего синего цвета горы Сиан была неоценимой в наблюдении за развивающимся хрящом мекеля и обычно использовалась для визуализации окончательной клеточной организации для дальнейшего анализа развивающихся хондроцитов с течением времени и отслеживания линии.

Использование трансгенных линий SOX 10 кДа было использовано для изучения миграции клеток, конвергенции и удлинения у живых эмбрионов с использованием визуализации трансгенной линии зебры Bow m. Для дальнейшего изучения организации хондроцитов в черепно-лицевой скелетной структуре выявлен процесс взаимного объединения и удлинения хондроцитов, который опосредует растяжение и рост хряща Меккеля. На этом рисунке показана нижняя челюсть из лука зебры UI M Sox 10 ERT двух трансгенных эмбрионов кри между 3D PF и пятью днями после оплодотворения.

Нижняя челюсть лучше всего изображена вентрально, чтобы обеспечить четкое представление об организации клеток в хряще мела, как показано здесь. Стабильно поддерживаемые и наследуемые цвета позволяют легко прослеживать родословную и картировать судьбу клеток черепного нервного гребня. Единственная голубая клетка мигрирует и интерполируется со своими соседними клетками, а затем удлиняется вдоль передней задней оси, образуя участок хондры равномерной формы, тем самым поддерживая глобальную форму хряща мела, поскольку он распространяется спереди.

Этот метод открывает путь для исследователей в области развития кошек для изучения хондро в формировании скелета данио-рерио.