Генеральный метод для обнаружения Nitrosamide формирование в метаболизм в Vitro нитрозамины, цитохром P450s

Общая цель данной методики состоит в том, чтобы определить, может ли цитохром Р450 процессно окислять n нитрозамины до n нитосамидов in vitro. Этот метод приносит пользу в области токсикологии, оценивая, метаболизируются ли нитозамины напрямую в нитрозамиды. Поскольку нитрозамиды относительно стабильны в алкилатной ДНК, они могут играть роль в канцерогенезе.

Основным преимуществом этой методики является использование высокочувствительного масс-спектрометра, который дает пределы обнаружения ниже, чем ранее достигаемые для аналогичных анализов метаболизма нитрозаминов in vitro. Чтобы начать эту процедуру, поместите в духовку колбу с круглым дном объемом 25 миллилитров, содержащую магнитную мешалку. Сушите в течение 16 часов при температуре 140 градусов Цельсия.

После этого переложите колбу в вытяжной шкаф и охладите ее под струей газообразного азота. Добавьте в колбу 31,8 миллиграмма норкотинина, пять миллилитров ангидрида уксусной кислоты и один миллилитр уксусной кислоты и начните помешивать. Переложите колбу на баню с ледяной водой.

Добавьте 33,3 миллиграмма нитрита натрия. Продолжайте помешивать в течение 2,5 часов, затем влейте реакцию в 18 миллилитров ледяной воды, чтобы погасить реакцию. Немедленно переложите раствор в разделительную воронку, содержащую 18 миллилитров DCM, и извлеките водный раствор.

Извлеките водный слой еще два раза, используя каждый раз 9 миллилитров DCM. Затем высушите скапливающуюся органику свыше 100 мг сульфата магния в течение двух минут. После фильтрации используйте ротационный испаритель для концентрирования раствора при температуре 30 градусов Цельсия с получением сырой желтой нефти.

Очистите сырое соединение с помощью колоночной хроматографии, как указано в текстовом протоколе. После этого растворите чистое соединение в одном миллилитре дейтерированного хлороформа. С помощью ЯМР подтвердите структуру и молярность раствора, как указано в текстовом протоколе.

Храните этот раствор в темноте при температуре от двух до восьми градусов Цельсия до тех пор, пока он не понадобится. Затем подтвердите точную исходную массу и определите массу ионов продукта чистого раствора НЯЦ путем прямой инфузии на масс-спектрометре с высоким разрешением, как указано в текстовом протоколе. Для начала достаньте необходимые реагенты из морозильной камеры при температуре 80 градусов Цельсия, и разморозьте на льду.

После размораживания используйте реакционный буфер с концентрацией 0,5 для разбавления бакулосом в системе регенерации NADPH 1-10 и 1-50 соответственно в одномиллилитровой пробирке. Затем добавьте три микролитра стокового раствора NADP в одну миллилилитровую пробирку, содержащую 97 микролитров реакционного буфера с концентрацией 0,5. Для каждой инкубации приготовьте одну миллилилитровую пробирку, добавив 40 микролитров четырехмикролярного раствора NNN, приготовленного с реакционным буфером.

Добавьте в каждую пробирку 50 микролитров раствора фермента, содержащего пять пикомолев Р450 2А6. Предварительно выдержать на водяной бане при температуре 37 градусов в течение двух минут. Затем добавьте в каждую пробирку по 10 микролитров разведенного раствора НАДФ+.

Инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия от одной до 30 минут. После этого сначала добавьте 10 микролитров 3,0 нормального сульфата цинка, а затем добавьте 10 микролитров 3,0 нормального гидроксида бария, чтобы погасить реакцию. Вихревым раствором образуется белый осадок.

Затем центрифугируйте при восьми тысячах g в течение четырех минут. Немедленно соберите надосадочную жидкость и проанализируйте два микролитра с помощью жидкостной хроматографии, положительного наноэлектроспрея, ионизации высокого разрешения, тандемной масс-спектрометрии. В этом исследовании норкотинин нитрозируется до NNC чисто и с высоким выходом, что является стандартом для использования в эксперименте in vitro.

Успешность реакции подтверждена спектроскопическим анализом, в том числе тандемной масс-спектрометрией с высоким разрешением, которая подтвердила, что масса родителя находится в пределах пяти частей на миллион от теоретического значения. Затем с помощью тандемной масс-спектрометрии фрагментации NNC определяют наиболее распространенные массы ионов продукта. Как видно, два наиболее распространенных продукта ионов — 134 и 162 с точным определением массы с точностью до пяти знаков после запятой.

Синтезированный NNC затем используется в качестве стандарта для анализа метаболизма P450 in vitro. В используемых условиях синтетический НЯЦ элюируется примерно через 17,5 минут, с хорошо разрешенными пиками как в ионном канале родителя, так и в ионном канале продукта. В соответствии с положительным контролем, образование НЯЦ наблюдается в течение одноминутной, пятиминутной и 10-минутной инкубации.

При правильном выполнении инспектоскопический анализ синтеза нитрозамидов может быть выполнен примерно за шесть часов. Точно так же анализ in vitro с многократной инкубацией должен занимать не более восьми часов. Применение этого метода распространяется на оценку риска рака, связанного с употреблением табака, поскольку измерение биомаркеров, связанных с нитрозамидом, может быть информативным об индивидуальной активации нитрозаминов.

Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о быстрой обработке ферментной инкубации. Нитрозамиды гидролизуются в этих условиях и не должны долго находиться перед масс-спектрометрическим анализом. После просмотра этого видео вы должны иметь хорошее представление о том, как готовить стандарты нитрозамида, и оценить, образуются ли они in vitro правильной системой нитрозамина цитохрома P450.

Не забывайте, что работа с NNN, NNC или родственными канцерогенами может быть опасной. С этими соединениями всегда следует работать в вытяжном шкафу, надев лабораторный халат, защитные очки и перчатки. Кроме того, все канцерогенные отходы должны быть надлежащим образом сохранены и маркированы.