Поклеточного течения индуцированных слоеного применение ГАМК в мозге ломтиками

Общая цель этой методики заключается в проведении фармакологического введения при записи целоклеточного пластыря-зажима. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области электрофизиологии, такие как фармакологическое введение. Основное преимущество этой методики заключается в том, что концентрация препарата вокруг места записи быстро увеличивается, тем самым предотвращая десенсибилизацию мембранных рецепторов.

Как правило, новички в этом методе будут испытывать трудности, потому что подготовка острого среза префронтальной коры и положение слоеной микропипетки относительно сложны. Чтобы начать эту процедуру, измельчите застывший раствор для резки до получения слякоти. Держите слякотный раствор на льду и пузырите его с 95% кислорода и 5% углекислого газа.

Затем поместите рассеченную голову в стакан, наполненный ледяным раствором для резки, и выньте его через несколько секунд. Разрежьте череп по средней линии в каудально-ростральном направлении тонкими ножницами, а боковые части черепа удалите. Затем удалите мозг тонким шпателем и опустите его в ледяной раствор для резки.

После этого поместите мозг на крышку девятисантиметровой чашки Петри, наполненной льдом. Промойте мозг ледяным раствором для резки. Затем срежьте мозжечок и обонятельную луковицу лезвием бритвы.

Впоследствии нанесите цианоакрилатный клей на держатель образца Vibratome. Осторожно поместите мозговой блок на каплю клея ростральной стороной вверх и сразу же погрузите его в ледяной раствор для резки. Отрегулируйте держатель лезвия под углом 15 градусов по отношению к горизонтальной плоскости.

Разрежьте ткани мозга на корональные срезы размером 350 микрон. Затем перенесите предметные стекла в камеру восстановления, заполненную ACSF, и инкубируйте их в течение одного часа с постоянным барботированием 95% кислорода, 5% углекислого газа. В нашем эксперименте подготовка острого среза префронтальной коры также имеет решающее значение в процедуре.

Здоровый срез мозга — это активные нейроны, которые могут быть плотно заплатены. При этой процедуре изготовьте стеклянные боросиликатные микропипетки для использования в качестве записывающих электродов или слоеных микропипеток. Для регистрирующих электродов сопротивление наконечника находится в диапазоне от четырех до шести мегаом, в то время как объемные микропипетки имеют диаметр наконечника в диапазоне от двух до пяти микрометров.

Добавьте блокатор содионных каналов в ACSF для блокировки быстрого содионного канала и, следовательно, потенциалов действия, и поддерживайте постоянную скорость потока этого раствора в двух-трех миллилитрах в минуту в камере записи. Постоянно добавляйте в ACSF 95% кислорода и 5% углекислого газа, чтобы обеспечить жизнеспособность ломтиков. Перенесите срез мозга в записывающую камеру с помощью пастеровской пипетки с тонким концом, срезанным по размеру среза.

Затем поместите якорь из платинового среза над срезом, чтобы удерживать его на платформе. После этого заполните записывающие микропипетки внутренним раствором, а надувные микропипетки заполните ГАМК на 10 микромоляров, 50 микромоляров и 100 микромоляров, или ACSF, в качестве управления транспортным средством. Чтобы предотвратить засорение мусором, приложите небольшое положительное давление с помощью одномиллилитрового шприца перед погружением записывающего электрода в ACSF.

Расположите записывающий электрод под микроскопом и затяните микропипеткой так, чтобы кончики оказались в центре монитора. Затем определите целевой нейрон. Отрегулируйте фокус микроскопа, постепенно опуская пуховую микропипетку, и расположите ее над регистрирующим нейроном под углом 45 градусов.

Соблюдайте расстояние между кончиком пуховой микропипетки и целевым нейроном в пределах от 20 до 40 микрометров. Медленно и осторожно подойдите к нейрону с помощью записывающего электрода, а затем отпустите положительное давление. Примените слабое и кратковременное всасывание через трубку, соединенную с держателем электрода, чтобы создать гигаомное уплотнение.

Поддерживайте напряжение на уровне нуля милливольт. После образования гигаомного уплотнения компенсируйте быструю и медленную емкость вручную или автоматически. Затем примените кратковременное и сильное всасывание через трубку, чтобы перейти в режим цельных ячеек.

Впоследствии запись вызванных IPSC токов в режиме напряжения клещей. Подавайте одиночные или спаренные слойки GABA через микропипетку, управляемую импульсным генератором напряжения Master-8. Изменяйте продолжительность затяжки, чтобы получить наилучшие результаты вызванных IPSC-токов, и измеряйте вызванные IPSC-токи в модели депрессии, вызванной LPS.

Здесь показаны образцы IPSC, индуцированные 10, 50 и 100 микромолярными ГАМК. А вот кривые длительности отклика затяжки. Здесь показаны повторяющиеся токи, вызываемые ГАМК при 50 микромолярных затяжках с интервалами в одну, две или три секунды.

Однажды, освоив, эту технику можно сделать за два часа, если ее правильно выполнить. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о том, что нужно получить здоровые срезы мозга. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области фармакологического администрирования к изучению влияния лекарства на электрофизиологию.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как проводить фармакологическое введение при записи цельноклеточного пластыря-зажима. Не забывайте, что работа с ТТХ может быть чрезвычайно опасной и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение перчаток.