4.6: Инвазионный анализ с использованием 3D матриц

Ученые разработали 3D-модели для более точного изучения процессов инвазии и миграции клеток. В то время как большинство традиционных систем клеточных культур являются двумерными, клетки в наших тканях существуют внутри трехмерной сети молекул, известной как внеклеточный матрикс или ECM. В то время как многие механистические процессы, необходимые для подвижности клеток в 2D и 3D, схожи, такие факторы, как пониженная жесткость ВКМ по сравнению с пластиковыми поверхностями, добавление третьего измерения для миграции и физические препятствия для перемещения через сетку длинных полимеров в ВКМ, представляют собой различные проблемы для клетки по сравнению с двумерной миграцией.

В этом видео мы кратко познакомимся с основными функциями и структурой ВКМ, а также с механизмами, с помощью которых клетки модулируют и мигрируют через нее. Далее мы обсудим общий протокол, используемый для изучения инвазии эндотелиальных клеток. Наконец, мы выделим несколько применений 3D-матриц для изучения различных биологических вопросов.

Давайте начнем с изучения состава ВКМ и того, как клетки взаимодействуют с ней.

ВКМ выполняет множество функций, таких как обеспечение поддержки клеток, облегчение межклеточной коммуникации и разделение тканей. Состав ВКМ варьируется в разных тканях и имеет разные биологические свойства, но его можно разделить на два больших типа. Базальная мембрана служит для закрепления и разделения тканей, в то время как интерстициальный матрикс окружает и поддерживает клетки внутри ткани. Интерстициальный матрикс в основном состоит из волокнистого белка коллагена, но также включает эластин и фибронектин.

Для миграции клеток через ВКМ должно произойти несколько биологических процессов. Первый — это адгезия клеточного матрикса, в которой участвуют трансмембранные белки, называемые интегринами. Они связывают ВКМ с внутренним каркасом клетки, известным как цитоскелет.

Еще одним процессом является структурная перестройка цитоскелета клетки. Это приводит к образованию специализированных структур, называемых инвадоподиями, которые представляют собой выпячивания клетки в окружающий ее матрикс. Последним этапом является модуляция ECM. Обычно в этом участвуют деградирующие молекулы, известные как матричные металлопротеимы или ММП, которые накапливаются в инвадоподиях и разрушают окружающую ВКМ, способствуя клеточной инвазии. Анализы 3D-матричной инвазии позволяют ученым визуализировать и изучить этот сложный процесс.

Теперь, когда вы знакомы с ВКМ и ее взаимодействием с клетками, давайте рассмотрим протокол изучения инвазии ВКМ эндотелиальными клетками с образованием канальцев. Культивируя эндотелиальные клетки в трехмерной среде, можно смоделировать биологический процесс роста кровеносных сосудов, также известный как ангиогенез, который важен как во время нормального развития, так и при раке.

Сначала культивируют эндотелиальные клетки, и получают одноклеточную суспензию путем обработки клеток протеазами, такими как трипсин, и пропускания их через сетчатый фильтр для разрушения клеточных сгустков. 3D-матрица, обычно состоящая из коллагена, фибрина, ламинина или более сложных комбинаций этих компонентов, которые могут быть приготовлены в лаборатории или заказаны у коммерческих поставщиков, затем размораживается на льду. Поскольку большинство препаратов ЭХМ полимеризуются при более высоких температурах, полезно держать в холоде и другое оборудование и реагенты. Клеточную суспензию смешивают с размороженным раствором матрицы для встраивания клеток, и эту смесь помещают в инкубатор для клеточных культур, где более высокая температура вызовет полимеризацию матрицы.

После того, как клеточная матрица схватывается, в матричную чашку добавляют питательные среды, содержащие ангиогенные факторы. С помощью программного обеспечения для покадровой микроскопии можно отслеживать отдельные клетки, чтобы наблюдать за их миграцией через матрицу. Полученные изображения анализируются, а положение клеток используется для вычисления направления движения и расстояния в микронах. Затем эти значения могут быть построены на графике для определения локомоторной активности — средней скорости миграции клеток. Наконец, формирование сети труб отслеживается и анализируется с помощью программного обеспечения для визуализации для идентификации таких объектов, как узлы, трубы и петли.

Теперь давайте рассмотрим несколько применений 3D-матриц в конкретных экспериментах.

Миграция клеток опосредована активной модуляцией клеточного цитоскелета. В этом эксперименте коллагеновые матрицы были подготовлены и смешаны с красителем, содержащим красный флуоресцентный белок, чтобы обеспечить визуализацию. Отдельные клеточные сфероиды, которые представляют собой свободно плавающие клеточные кластеры, были выделены и встроены в коллагеновый матрикс. После инкубации встроенные клетки окрашивали на специфические компоненты цитоскелета и визуализировали с помощью флуоресцентной микроскопии. Исследователи наблюдали компоненты цитоскелета и их изменения по мере миграции клеток через ВКМ.

Ученые также могут изучить, как свойства ECM влияют на миграцию. Используя концентрическую гелевую систему, в которой клетки встроены во внутреннюю гелевую матрицу, окруженную внешними матрицами различной концентрации, ученые могут отслеживать клетки с помощью покадровой микроскопии для изучения их миграции от внутреннего геля к изначально свободному от клеток внешнему гелю. Исследователи заметили, что большая жесткость гелей с более высокой концентрацией привела к увеличению как смещения клеток, так и общего расстояния миграции клеток.

Наконец, анализы матриксной инвазии могут быть проведены на живом животном для изучения ангиогенеза в органоспецифическом контексте. Здесь были созданы фибриновые гели, обычно используемые в тканевой инженерии из-за их биоразлагаемой природы, с последующей имплантацией в легкие мыши, где гели удерживались на месте с помощью «клея», сделанного из белка фибриногена. Миграция клеток и образование новых кровеносных сосудов происходили в течение следующих 7-30 дней, после чего легкие и фибриновые гели были собраны, зафиксированы и разделены. Визуализация этих срезов выявила образование кровеносных сосудов и альвеол в имплантированных гелях, что дало исследователям представление об этом важнейшем аспекте развития легких в его in vivo.

Вы только что посмотрели видео JoVE об анализах инвазии внеклеточного матрикса. В этом видео обсуждался состав ВКМ и то, как клетки мигрируют через него, был представлен простой протокол изучения миграции эндотелиальных клеток через 3D-матрицу, а также освещались несколько клеточных процессов, которые в настоящее время изучаются в контексте взаимодействий клетки и ВКМ. Поскольку эндогенная миграция клеток происходит в трехмерном пространстве, эти биологические условия лучше всего моделируются с помощью методов 3D-культивирования. Усовершенствования в составе матрицы позволят ученым более точно воспроизводить и изучать клеточную миграцию в лаборатории. Как всегда, спасибо за просмотр!