Глубокая протеома профилирование Изобарический маркировки, обширные жидкостная хроматография, масс-спектрометрии и при содействии программного обеспечения количественной оценки

Общая цель этого эксперимента состоит в том, чтобы идентифицировать и точно количественно оценить более 10 000 белков из клеточного или тканевого лизата при различных методах лечения, временных циклах или биологических условиях. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области медицины или биологии, например, какие белки изменяются в ответ на лекарство или другой биологический стимул. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она обладает способностью точно количественно определять более 70% экспрессируемого протеома в 10 различных экспериментальных условиях.

Применение этой технологии может быть распространено на диагностику заболеваний человека за счет потенциального открытия биомаркеров. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку оптимальный лизис клеток и оценка жидкости играют ключевую роль в последующих процедурах пищеварения, маркировки и разделения. Чтобы начать этот протокол, получите культивируемые клетки, представляющие интерес.

Промойте ячейки дважды, используя 10 миллилитров PBS для каждой промывки. Соскребите и соберите промытые клетки в пробирку объемом 1,5 миллилитра, содержащую один миллилитр PBS. Центрифугируйте при 600 умноженных на g и четырех градусах Цельсия в течение пяти минут.

Достаньте надосадочную жидкость и храните при температуре минус 80 градусов Цельсия до готовности лизировать клетки. Соберите и взвесьте желаемые ткани быстро после вскрытия. После этого сразу же храните их в жидком азоте и храните при температуре минус 80 градусов по Цельсию.

Подготовьте буфер для лизиса в день проведения эксперимента, как указано в текстовом протоколе. Добавьте буфер для лизиса к замороженному образцу таким образом, чтобы соотношение буфера к образцу составляло 10 к одному, а конечная концентрация белка составляла от пяти до 10 миллиграммов на миллилитр. Затем добавьте стеклянные шарики и с помощью блендера лизируйте образцы при температуре четыре градуса Цельсия и скорости восемь, смешивая в течение 30 секунд, а затем отдыхая в течение пяти секунд, повторяя это пять раз или пока образцы не станут гомогенизированными.

Измерьте концентрацию белка с помощью стандартного количественного анализа белка или полиакриламидного геля, окрашенного в Кумасси, с использованием стандарта BSA. После этого добавьте 100% ацетонитрил так, чтобы конечная концентрация составила 10%, а протеаза Lys-C находится в соотношении фермента к субстрату один к 100. Инкубируйте при комнатной температуре в течение двух часов, чтобы произошло переваривание белка.

Затем добавьте DTT так, чтобы конечная концентрация составила один миллимоляр. Выдерживать при комнатной температуре в течение одного часа. Далее добавьте 50 миллимолярных HEPES до тех пор, пока концентрация мочевины в образцах не уменьшится до двух моляров.

Добавляйте трипсин в каждый образец в соотношении трипсина к белку один к 50. Выдерживать при комнатной температуре не менее трех часов. Далее добавляйте DTT до тех пор, пока его концентрация снова не составит один миллимоляр и инкубируйте при комнатной температуре в течение двух часов.

Добавляйте йодоацетамид так, чтобы его конечная концентрация составляла 10 миллимоляров. Выдерживать в темноте 30 минут при комнатной температуре. После этого угасите любой непрореагировавший йодоацетамид, добавив DTT таким образом, чтобы его конечная концентрация составляла 30 миллимоляров.

Выдерживать при комнатной температуре в течение 30 минут. Проверьте эффективность усвоения трипсина, как указано в текстовом протоколе. Затем добавьте ТФК в каждый образец так, чтобы конечная концентрация составила 1%. С помощью полоски для измерения pH измерьте pH каждого образца, чтобы убедиться, что он находится в диапазоне от двух до трех.

Добавляйте дополнительные ТЖК по каплям, если это необходимо, чтобы достичь неприемлемого pH. Центрифугируйте образцы при 20 000 умноженных на g и комнатной температуре в течение 10 минут. Соберите надосадочную жидкость и загрузите образцы на подготовленные спиновые колонки.

Центрифугируйте при 100-кратном g в течение трех минут или до тех пор, пока образец полностью не пройдет через колонку для связывания образцов. Далее добавьте 0,5 миллилитра 0,1% ТЖК в каждую колонку. Центрифугируйте при 500 умноженных на g в течение 30 секунд.

После этого добавьте в каждую колонку по 125 микролитров раствора, содержащего 60% ацетонитрила и 0,1 ТФК. Центрифугируйте при 100-кратном g в течение трех минут, чтобы вымыть пептиды из колонки. Восстановите каждый образец обессоленного пептида в 50 микролитрах 50 миллимолярных HEPES.

С помощью полоски pH убедитесь, что pH каждого образца находится в диапазоне от семи до восьми. Далее растворите реагенты ТМТ в безводном ацетонитриле, добавьте их в образцы, а затем инкубируйте при комнатной температуре в течение одного часа. После этого с помощью наконечников для дозатора объемом 10 микролитров, встроенных в хроматографическую среду, обессолите один микрограмм каждого образца и проанализируйте эффективность мечения, как указано в текстовом протоколе.

Исследуйте от 6 до 10 отдельных пептидов, чтобы убедиться, что немеченые пептиды не обнаруживаются в меченых образцах. Затем смешайте примерно два микролитра каждого образца вместе. Используйте наконечники для дозатора объемом 10 микролитров, в которые встроен фильтрующий материал для хроматографии, чтобы обессолить эту смесь.

Анализируйте образцы с помощью ЖХ-МС/МС, как указано в текстовом протоколе. Для начала растворите обессоленный объединенный образец пептида, меченного TMT, в 65 микролитрах буфера А. Используйте полоску pH, чтобы убедиться, что pH составляет примерно 8,0. Если образец все еще кислый, используйте гидроксид аммония для регулировки pH по мере необходимости.

Затем разделите образец на фракции, как указано в текстовом протоколе. Настройте сборщик фракций на сбор фракций каждые две минуты, включая время загрузки. Установите скорость потока на 0,4 миллилитра в минуту.

Соберите в общей сложности 80 фракций. Затем используйте вакуумный концентратор, чтобы полностью высушить каждый второй образец. Используя ЖХ-МС/МС, проанализируйте все 80 фракций для достижения сверхглубокого протеомного покрытия.

Сначала упакуйте смолу C18 размером 1,9 микрометра в пустые колонки внутреннего диаметра 75 микрометров, достигнув объема слоя примерно 1,3 микролитра. Сверните колонну два-три раза внутри нагревателя для портфеля бабочек, чтобы обеспечить нагрев по всей длине. Прикрепите колонку к внутренней стороне обогревателя, следя за тем, чтобы она не заклеивалась скотчем датчика температуры обогревателя.

Затем нагрейте колонну до 65 градусов по Цельсию. Пропустите 100 нанограммов пептидов мозга крысы через систему ЖХ-МС/МС, чтобы оценить качество системы. Повторите эту оценку еще один раз.

После этого загрузите примерно 0,2 микрограмма восстановленных пептидов в колонку, одновременно пропуская 5% буфер А. Выведите пептиды из колонки и проанализируйте с помощью масс-спектрометра, как указано в текстовом протоколе. В данном исследовании описан высокопроизводительный метод количественного определения белков с 10-плексной изобарической стратегией мечения. Эффективность мечения TMT изучается с помощью LC-MS/MS для анализа образцов, меченных TMT, и соответствующих немеченных образцов.

Как видно, пик немеченного пептида обнаруживается только в немеченном образце, в то время как меченый ТМТ пептидный пик обнаруживается только в меченом образце. Далее оценивается влияние окна изоляции MS2 на помехи. Все сканирования MS2 обозначаются как чистое или зашумленное.

В то время как при чистом сканировании обнаруживаются ионы y1 только лизина, при зашумленном сканировании они обнаруживают их как в лизине, так и в аргинине. Здесь показано репрезентативное удаление интерференции с помощью пептидов E.coli, индивидуально меченных тремя различными реагентами TMT. Суммарные относительные интенсивности показывают, что коррекция y1 на основе ионов более точна для количественного определения на основе TMT.

После освоения этот протокол может быть завершен за четыре-пять недель, если все сделано правильно. При попытке выполнить эту процедуру очень важно убедиться, что все шаги контроля качества выполнены полностью, чтобы окончательный набор данных был максимально точным. Адаптация этой процедуры для сосредоточения внимания на посттрансляционных модификациях может ответить на другие вопросы, такие как изменение убиквитинирования, фосфорилирования или ацетилирования в ответ на прогрессирование заболевания или медикаментозное лечение.

После своей разработки эта технология открыла путь исследователям в области продуктов для изучения белковых изменений в клетках и тканях. После просмотра этого видео у вас должно сложиться очень хорошее понимание того, как идентифицировать и точно количественно определить более 10 000 белков из клетки или ткани млекопитающего. Не забывайте, что работа с высоким давлением UPLC и небольшим количеством кварцевых колонок может быть чрезвычайно опасной, поэтому при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение защитных очков.

Впервые идея этого метода пришла нам в голову, когда мы начали решать известную проблему сжатия отношений, которая возникает при изобарическом мечении. Мы поняли, что экстенсивное фракционирование является отличным способом не только облегчить эту проблему, но и повысить идентификацию белков и пептидов, которые могут еще больше увеличить и адаптировать протеомный анализ.