Анализ TUNEL

Анализ TUNEL чаще всего используется для обнаружения клеток, подвергающихся апоптозу, который является формой запрограммированной гибели клеток. Апоптоз является важным биологическим процессом во время развития и для поддержания гомеостаза тканей. Окрашивание TUNEL позволяет визуализировать и количественно оценить апоптотические клетки. Это помогает ученым проверить эффективность новых методов лечения заболеваний, при которых апоптоз либо ингибируется, как при раке, либо усиливается, как при нейродегенерации.

В этом видео будет объяснено, как анализ TUNEL может быть использован для мечения клеток, подвергающихся апоптозу, пошаговый протокол выполнения этого метода на срезах тканей и как исследователи применяют эту технику для понимания механизмов гибели клеток.

Прежде чем углубиться в протокол анализа TUNEL, давайте обсудим принципы, лежащие в основе этой методики.

Одной из многих отличительных характеристик апоптоза является фрагментация ДНК. Как происходит фрагментация ДНК? Апоптоз осуществляется ферментами, называемыми каспазами, присутствующими в цитозоле. Их основная роль заключается в расщеплении белков с целью демонтажа клетки. Кроме того, каспазы активируют фермент под названием каспаза-активируемая ДНКаза, или CAD, отделяя его от ингибитора — ICAD. Активированная ИБС — это эндонуклеаза, которая перемещается к ядру и расщепляет хромосомную ДНК.

Расщепление ДНК в конечном итоге приводит к накоплению фрагментов ДНК с зазубренными концами, и анализ TUNEL флуоресцентно помечает эти зазубренные концы фрагментированной ДНК, что позволяет ученым обнаружить апоптоз. Но как это происходит? Для этого вы должны понимать реакцию TUNEL. TUNEL расшифровывается как терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза-опосредованная мечение dUTP nick-ending. Двумя основными реагентами TUNEL являются терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза, или TdT, и дезоксиуридинтрифосфат, или dUTP, которые могут быть флуоресцентно помечены для облегчения обнаружения.

Чтобы понять реакцию TUNEL, давайте вернемся к апоптотическим клеткам с фрагментами ДНК. Эти зазубренные фрагменты имеют свободные 3'-гидроксильные группы. После добавления реагентов TUNEL в образец, содержащий апоптотические клетки, флуоресцентно меченые dUTP присоединяются к этим 3'-гидроксильным группам с помощью каталитического фермента TdT. Клетки, окрашенные с помощью этой процедуры, называются TUNEL-положительными клетками, которые затем могут быть визуализированы с помощью флуоресцентной микроскопии.

Теперь, когда вы понимаете основные принципы и концепции, лежащие в основе анализа TUNEL, давайте изложим общий протокол выполнения этой техники на срезах тканей. Основными этапами анализа TUNEL являются фиксация интересующей ткани, пермеабилизация ткани, добавление реагентов TUNEL, остановка реакции TUNEL и, наконец, анализ.

Во-первых, интересующая ткань должна быть зафиксирована, чтобы сохранить биологические структуры. Фиксация работает путем сшивания белков внутри клеток. Для анализа TUNEL ткани могут быть зафиксированы путем добавления их в раствор, содержащий 4% параформальдегида, в течение 4–24 часов при 4°C. После фиксации проводится криосекция ткани на тонкие срезы размером 10 мкм или менее.

Следующим этапом является пермеабилизация, которая позволяет реагентам, таким как фермент TdT, проникать в ядро клетки. Пермеабилизацию участков ткани можно проводить путем добавления ткани в раствор протеиназы К в течение 5–15 минут при 37°С. Срезы ткани промывают фосфатно-солевым буфером на орбитальном шейкере в течение 15–30 минут при комнатной температуре.

После пермеабилизации фермент TdT и флуоресцентно меченые dUTP добавляют в участки ткани вместе с меченым буфером, содержащим кобальт, который действует как кофактор для реакции TUNEL. Реакционную смесь TUNEL и тканевый срез инкубируют в течение 1–3 часов при температуре 37°C и защищают от света для предотвращения затухания флуоресценции.

После инкубации в срез ткани добавляют стоп-буфер, чтобы остановить реакцию TUNEL, и после короткой инкубации срезы промывают фосфатным раствором. Наконец, срезы тканей, окрашенные с помощью флуоресцентно помеченного dUTP, визуализируются с помощью флуоресцентной микроскопии и оцениваются на предмет локализации TUNEL-положительных клеток в данной ткани. Можно количественно оценить гибель клеток, просто подсчитав процент положительных клеток TUNEL в данном участке ткани.

Теперь, когда вы узнали, как провести анализ TUNEL для обнаружения апоптотических клеток, давайте обсудим, как этот анализ может быть использован для ответа на вопросы, которые задают клеточные биологи.

Гибель клеток происходит как нормальная часть развития для формирования тканей и структур, а также для уничтожения ненужных клеток. Поэтому ученые, заинтересованные в этом явлении, изучают влияние пренатального воздействия различных веществ на апоптоз во время развития. Здесь ученые были заинтересованы в изучении влияния пренатального воздействия алкоголя на развитие мозга. Результаты окрашивания TUNEL, выполненного на мозге плода, выявили повышенный апоптоз в тканях, которые пренатально подвергались воздействию алкоголя, по сравнению с контрольными животными.

Ученые также используют анализ TUNEL для изучения апоптоза в ответ на бактериальную инфекцию. В этом эксперименте ученые разработали модель пневмонии, вводя мышам Pseudomonas aeruginosa, который вызывает воспаление легких. Затем была удалена легочная ткань и проведено окрашивание TUNEL для изучения апоптоза в ответ на бактериальную инфекцию. Результаты показывают, что гибель апоптотических клеток увеличилась у мышей, подвергшихся воздействию бактерий, по сравнению с контрольными животными.

Наконец, окрашивание TUNEL может быть использовано на образцах опухолей человека для определения реакции опухоли на лекарства. В этом примере образцы опухолей были собраны у пациентов и культивированы ex vivo. Затем их лечили доклиническими препаратами и оценивали реакцию с помощью анализа TUNEL. Полученные данные показывают, что лечение препаратом, ингибирующим белок теплового шока 90, значительно увеличивает апоптоз в опухолевой ткани.

Вы только что посмотрели видео JoVE об использовании анализа TUNEL для обнаружения клеток, подвергающихся апоптозу. В этом видео были рассмотрены принципы окрашивания TUNEL и пошаговый протокол проведения анализа TUNEL на срезах тканей. Мы также рассмотрели, как этот метод может быть применен для понимания запрограммированной гибели клеток во время развития и болезни. Как всегда, спасибо за просмотр!