Дифференциального воздействия гиполипидемические препараты в модуляции морфологией частиц холестерина

Общей целью данного исследования является оценка влияния гиполипидемических препаратов на модуляцию морфологических особенностей холестериновых частиц с помощью метода матрицы бляшек, а также выявление потенциальных биомаркеров для диагностики атеросклероза и определения эффектов препарата. Роль гиполипидемических препаратов в модуляции образования холестериновых частиц плохо изучена. В данной работе мы показываем, что гиполипидемические препараты играют непосредственную роль в изменении профилей и морфологических особенностей образования холестериновых частиц.

Основное преимущество матрицы бляшек на основе метода визуализации in vitro перед другими методами обнаружения частиц заключается в том, что она позволяет визуализировать частицы холестерина для оценки эффекта гиполипидемических препаратов в сыворотке крови. Джейсон Ландри, лаборант компании Plaxgen, продемонстрирует, как мы настраиваем анализ матрицы бляшек с помощью химического анализатора. Раймонд Конг, старший научный сотрудник Millipore Sigma, продемонстрирует, как мы выполняем обработку образцов с помощью проточной цитометрии.

Наконец, Дэвид Лю, лаборант компании Plaxgen, продемонстрирует анализ данных для изображений холестериновых частиц. Используйте биохимический анализатор-1 для настройки анализа матрицы бляшек на образование холестериновых частиц. На протяжении всего анализа поддерживайте конечный объем реакции в каждой лунке на уровне 200 микролитров и выполняйте все анализы в трех экземплярах.

Сначала загрузите 194 целых пять микролитров фосфатно-солевого буфера, или PDS, в каждую лунку 96-луночного планшета с круглым дном и низким связыванием белков. В каждую лунку добавляют по две целых пять микролитров каждого гиполипидемического раствора препарата, в отрицательные контрольные образцы препарат не добавляют. Затем встряхните пластину в течение 30 секунд, поместив ее на реакционную пластину химического анализатора-1, чтобы равномерно перемешать лекарство в раствор.

Наконец, добавьте в каждую лунку по два микролитра раствора холестерина с флуоресцентной меткой. Встряхните пластину в течение 30 секунд, поместив ее на реакционную пластину химического анализатора-1, как и раньше. Затем инкубируйте планшет в лабораторном шейкере в течение двух часов, установленных при температуре 37 градусов Цельсия и 200 оборотах в минуту.

После инкубации получите изображения частиц с помощью проточной цитометрии. Откройте шаблон сбора данных, чтобы загрузить правильные настройки прибора. Нажмите «Файл», затем выберите «Загрузить шаблон» и выберите файл шаблона.

Нажмите кнопку Load (Загрузить), чтобы подготовить прибор к загрузке образца. Когда откроется диалоговое окно Загрузить образец, нажмите OK, чтобы загрузить 50 микролитров образцов в проточный цитометр визуализации. Подождите, пока частицы не будут видны в области визуализации в режиме реального времени.

Когда частицы в области изображения находятся в хорошем фокусе, нажмите кнопку «Получить», чтобы получить изображения каждого объекта одновременно с высокой пропускной способностью для темного поля, светлого поля, зеленой флуоресценции и желтой флуоресценции. В конце сбора данных нажмите кнопку «Вернуть», чтобы вернуть образец. Повторите эти шаги, чтобы получить от 5 000 до 10 000 частиц из каждого образца.

Анализируйте все файлы необработанных изображений с помощью программного обеспечения для анализа изображений для определения интенсивности флуоресценции объекта и морфологических вариаций, как описано в текстовом протоколе. Приготовьте 96-луночный планшет с круглым дном с низким содержанием белка, загружая реагенты поэтапно, используя конечный объем реакции 200 микролитров на лунку. Для начала подготовьте контрольные лунки.

Загрузите в каждую лунку по 193 микролитра PBS. Добавьте 2,5% сыворотки пациента, загрузив только один образец сыворотки в лунку. Затем встряхните пластину в течение 30 секунд, поместив ее на реакционную пластину химического анализатора.

Затем добавьте в каждую лунку по два микролитра раствора агрегата холестерина, меченного флуоресценцией. Снова встряхните пластину в течение 30 секунд, поместив ее на реакционную пластину химического анализатора-1. Чтобы подготовить лунки с препаратами, загрузите в каждую лунку по 191 микролитр PBS.

Затем добавьте 2,5% от каждой сыворотки пациента в лунку и встряхните планшет в течение 30 секунд, поместив его на реакционную пластину химического анализатора-1. Добавьте по два микролитра раствора эзетимиба, ловастатина, симвастатина или ниацина во все лунки, кроме отрицательных контрольных лунок. Добавление только одного препарата в лунку.

Продолжайте встряхивать тарелку в течение 30 секунд, как и раньше. Затем добавьте два микролитра флуоресцентно меченого раствора холестеринового агрегата в каждую лунку перед встряхиванием тарелки в течение 30 секунд. Затем инкубируйте планшет в течение двух часов в лабораторном шейкере, установленном на 37 градусов Цельсия и 200 оборотах в минуту.

После инкубации получите образцы с помощью проточной цитометрии с помощью визуализации с теми же настройками, что и раньше. Используйте программное обеспечение для анализа изображений для пакетной обработки всех файлов изображений, как описано в текстовом протоколе. Здесь представлены репрезентативные результаты, показывающие идентификацию шаровидных и линейных частиц холестерина, индуцированных статинами, с помощью неферментативного механизма.

Показано подтверждение двух различных морфологий образования холестериновых частиц, индуцированных другими гиполипидемическими препаратами. В том числе эзетимиб, ниацин, фибрат и омега-3 жирные кислоты. Здесь показаны точечные диаграммы, на которых по оси X отображается спектр частиц холестерина, обнаруженных в зеленом флуоресцентном канале.

А ось Y отображает боковое рассеяние, стробирование показывает области липопротеинов очень низкой плотности, липопротеинов низкой плотности и частиц липопротеинов высокой плотности, обнаруженных на флуоресцентных точечных графиках. Эти результаты демонстрируют, как гиполипидемический эффект изменяет профили очищенных частиц холестерина ЛПОНП и ЛПНП в присутствии без применения препарата, эземида, ловастатина, симвастатина и ниацина. Здесь показан скрининг трех различных образцов сыворотки для идентификации дифференциального эффекта различных гиполипидемических препаратов, которые модулируют профили образования частиц холестерина ЛПОНП, ЛПНП и ЛПВП.

Эти профили указывают на то, что также существуют различия в уровнях ответа между тремя различными образцами сыворотки. Скрининг первого образца сыворотки крови на глобулярные и линейные частицы холестерина, образовавшиеся без применения препарата и в присутствии различных гиполипидемических препаратов, подтверждает две различные морфологии частиц холестерина, полученных из сыворотки крови, демонстрируя как глобулярную, так и линейную форму цепи. Таким образом, мы успешно продемонстрировали подход к визуализации in vitro для определения эффекта гиполипидемических препаратов, которые модулируют связь с образованием холестериновых частиц и их клиническую значимость.

Наши предварительные результаты являются многообещающими, и мы находимся в процессе дальнейшей валидации этого анализа массива бляшек с использованием крупномасштабных клинических образцов. Стандартная липидная панель измеряет уровень холестерина ЛПНП и ЛПВП в сыворотке. Наш анализ бляшек надеется повысить точность оценки риска развития атеросклероза и прогнозирует липолипидемическую реакцию на лекарственные препараты с помощью сыворотки.