Оптимизированная Отрицательный Окрашивание: Высокая пропускная протокол за рассмотрение Малый и Asymmetric Protein Structure по электронной микроскопии

Более половины белков небольшие белки (молекулярная масса <200 кДа), которые являются сложными как для электронного микроскопа изображений и трехмерных реконструкций. Оптимизированная отрицательное окрашивание это протокол надежной и высокой пропускной получить высокую контрастность и относительно высокое разрешение (~ 1 нм) образы малых асимметричных белков или комплексов при различных физиологических условиях.

Общая цель этой процедуры заключается в том, чтобы получить изображение маленького и асимметричного белка с использованием высокопроизводительного оптимизированного протокола электронной микроскопии с отрицательным окрашиванием. Это достигается путем предварительной инкубации белка на подготовленной инкубационной станции и подготовки рабочей станции с отрицательным окрашиванием. Второй этап процедуры заключается в быстром промывании образца по три капли воды последовательно.

Третий шаг – тщательно прокрасить образец на три капли пятна последовательно. Заключительным этапом является удаление излишков раствора путем промокания с обратной стороны ЭМ-сетки и последующего осторожного высыхания под воздействием газообразного азота. В конечном счете, результаты могут показать изображения малых белков с высоким разрешением с помощью ПЭМ-визуализации в условиях низкой расфокусировки.

Основное преимущество этой методики перед криоэлектромикроскопической заключается в наборе. Это может обеспечить высокую пропускную способность и высококонтрастную визуализацию небольших и асимметричных белковых структур, уменьшая при этом артефакты структуры от обычного негативного окрашивания. Тем не менее, этот метод может дать представление о структурной основе малых белковых механизмов, таких как белок переноса эфира холестерина.

Он также может быть применен к другим белкам, таким как антитело IgG, липопротеины высокой плотности и протеасомы, которые сильно различаются по размеру. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как этапы стирки и окрашивания трудно освоить из-за различий во времени, и даже промокание образца может вызвать драматические эффекты в готовом окрашенном белке. При подготовке к этому протоколу необходимо изготовить 1%-ный писсуарный раствор восьмой формы, уделяя максимальное внимание минимизации его воздействия света.

Это включает в себя обертывание шприца N 0,2 микрон фильтрующими частями в фольгу, когда приходит время первой фильтрации раствора. После фильтрации храните аликвоты, завернутые в двухмиллилитровую фольгу, при температуре минус 80 градусов Цельсия в день эксперимента. Разморозьте аликвоту на водяной бане комнатной температуры, как только полностью оттает.

Снова отфильтруйте его через фильтр 0,02 микрона с деталями, завернутыми в фольгу. Флакон для сбора также следует завернуть в фольгу. Перенесите негативное пятно в холодильник до тех пор, пока оно не будет использовано.

Сделайте лист для удержания капель, прижав восьмидюймовый элемент длины к опоре наконечника пипетки. При этом делаются дорожные углубления, которые служат колодцами диаметром пять миллиметров. Сделав шесть рядов лунок, разровняйте лед на поверхности пенопластового лотка, затем положите лист на лед.

Далее добавьте 35 микролитров воды DI в первые три лунки листа с левой стороны. Затем загрузите три правильные лунки в листе 35 микролитрами приготовленного раствора для отрицательных морилок. Накройте лоток крышкой, чтобы свести к минимуму попадание раствора на свет.

Это будет служить в качестве станции окрашивания. Теперь подготовьте инкубационную станцию с электромагнитной сеткой из пустой коробки для наконечника для пипетки с насадкой, на которую можно установить пинцет. Наполните коробку льдом наполовину так, чтобы поверхность льда была близко к кончику пинцета, когда они установлены.

Сначала разряжайте тонкие медные электромагнитные решетки с углеродным покрытием 300 меш в течение примерно 10 секунд. Далее возьмите в руки сетку с пинцетом, которая цепляется за инкубационную станцию ЭМ-сетки. Повесьте пинцет на сетку так, чтобы сетка находилась под наклоном 45 градусов на полдюйма над льдом.

Теперь разведите образец белка в DPBS в соотношении от 50 до 100 микрограммов белка на миллилитр раствора. Сразу же нанесите около четырех микролитров разбавления на ЭМ-сетку. Дайте образцу поинкубироваться около минуты.

Через минуту быстро промокните сетку фильтровальной бумагой, чтобы удалить излишки раствора. А затем на станции окрашивания прикоснитесь сеткой до первой капли воды на парапленке. Быстро повторите процесс сушки фильтра и повторите его следующей каплей.

Используйте в общей сложности три капли воды и сделайте это как можно быстрее. Промывать сетку водой необходимо быстро, чтобы избежать неблагоприятного влияния буферного изменения белка. После того, как в течение трех секунд смываем последнюю стирку, начните плавать сеткой на первой капле отрицательного раствора для окрашивания.

Дайте ему поплавать там в течение 10 секунд. Тем временем очистите пинцет, вдавливая кончики в фильтровальную бумагу. Несколько раз после десятисекундной поплавка промокните раствор фильтровальной бумагой и запустите еще одну поплавку в следующую каплю пятна в течение двух секунд.

Очистите пинцет в течение двух секунд. Далее промокните сетку насухо и положите на нее третью каплю. На протяжении всей минуты накройте станцию окрашивания во время этого шага.

Для удаления пятна необходимо прикоснуться к тыльной стороне электромагнитной сетки в течение определенного периода времени, чтобы обеспечить равномерное высыхание сетки. Если фильтровальная бумага слишком долго соприкасается с пятном, то может быть удалено слишком большое количество пятна, что приведет к ухудшению изображения. Далее приступаем к сушке сетки.

Сначала прикоснитесь всей неуглеродистой стороной к фильтровальной бумаге, пока раствор не смахнется. Во-вторых, нанесите слабую струю газообразного азота. Теперь переложите решетку на блюдо, застеленное фильтровальной бумагой, и частично накройте блюдо.

Дайте решетке подсохнуть в посуде в течение 30 минут при комнатной температуре. В качестве альтернативы липидсодержащие образцы можно запекать при температуре 40 градусов Цельсия в течение часа. После полного высыхания перенесите ЭМ-решетку в ящик для хранения ЭМ-решетки, прежде чем начать, сначала выровняйте ЭМ.

Сверьте разрешение самого высокого видимого кольца оттаивания со спектром мощности углеродной пленки области отрицательно окрашенной сетки, которое должно быть лучше целевого разрешения. Затем для корректировки юстировки внимательно проверьте спектр мощности на участке углеродной пленки образца. При правильно выровненных условиях можно визуализировать более 20 тысяч колец, что соответствует визуализации лучше, чем пять ангстремов.

Кольца были изготовлены путем более скорного переноса изображения аморфного углерода под расфокусировкой 1,6 мкм и дозой 20,4 электронов на квадрат. Ангстрем. Теперь вернемся к ближайшему к шерцеровскому фокусу состоянию около 0,1 микрометра для визуализации малых белков во время исследования электромагнитной сетки. В идеале окрашенные участки обычно находятся у края более толстых окрашенных мутных участков при малом увеличении.

Структуру образцов липопротеинов изучали с помощью OPNS. Примеры включают рекомбинантную ЛПВП, человеческую плазму, ЛПНП, ЛПНП в плазме человека и ЛПОНП в плазме человека. Также были рассмотрены более мелкие структуры, такие как 53 килодальтон, CETP.

Это один из самых маленьких белков, успешно визуализированных с помощью eem. Наложение кристаллической структуры CETP очень хорошо соответствует изображению, очень динамично. Гетерогенные белки также рассматривались в антителах к иммуноглобулину G мощностью 160 килодальтон.

Были хорошо видны три поддомена. Более тщательное изучение антитела IgG one было использовано для сравнения с его кристаллической структурой. Кристаллическая структура антитела IgG one во многом совпадает с ЭМ-представлением этих антител, например, в положении доменов и их форме.

Другие рассматриваемые молекулы включают 28 килодальтон, свободный липид аполипопротеин А и протеасомы. По сути, метод OPNS значительно расширяет границы ЭМ-визуализации для небольших асимметричных структур, а также связанных с ними механистических исследований при попытке проведения процедуры. Важно максимально уменьшить воздействие реагента на пятно, чтобы быстро отмыть образец и использовать ближний фокус сокровищ для визуализации После этой процедуры.

Другие методы, такие как электронная томография, могут быть выполнены, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как нанометровое разрешение структур отдельных молекул и подтверждающие изменения между ними. После этой разработки эта технология проложила путь исследователям в области структурной биологии к изучению магнитов переноса кластерного эфира среди липопротеинов плазмы крови человека.