Мультиплексированных помощью иммунофлуоресцентного анализа и количественной оценки внутриопухолевых PD-1⁺ Тим-3⁺ CD8 клетки⁺ T

Общая цель этого мультиплексного иммунофлуоресцентного анализа заключается в автоматическом подсчете клеток на основе их фенотипа. Этот метод позволяет использовать мультифлуоресценцию и автоматический подсчет клеток для анализа фенотипа и функции опухолевых иммунных клеток в опухолевом микроокружении. Эта технология способствовала созданию двух типов составных прогнозов для предсказанных вами маркеров, полученных непосредственно из микроокружения опухоли.

Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, могут испытывать трудности, потому что процедура фенотипирования очень длительна, и полученные исходные данные требуют дальнейшей обработки. Впервые идея этого метода пришла нам в голову, когда мы попытались охарактеризовать фенотип и иммунологические взаимодействия анходж-мирантных клеток. После размораживания используйте бумажное полотенце, чтобы тщательно высушить предметные стекла вокруг участков ткани, а затем обведите ткани гидрофобной барьерной ручкой.

Когда барьер высохнет, зафиксируйте образцы в 100% ацетоне на пять минут, после чего последует двухминутная сушка на воздухе, затем промойте предметные стекла в TBS в течение 10 минут. Предварительно обработайте предметные стекла 3 каплями 0,1% Авидина в течение 10 минут в темноте, затем постучите или проведите по предметным стеклам, чтобы покрыть ткань раствором Авидина. Добавьте 3 капли 01% биотина в каждый образец, затем коснитесь или проведите биотином по образцам, а затем промойте TBS, как показано выше.

Затем блокируйте любое неспецифическое связывание 100 микролитрами 5% нормальной сыворотки в TBS на 30 минут при комнатной температуре. В конце инкубации постукивайте по предметным стеклам, чтобы удалить излишки сыворотки, и инкубируйте предметные стекла в 100 микролитрах первичного коктейля антител, представляющего интерес, в течение одного часа во увлажненной камере. Промойте помеченные предметные стекла антителами в TBST в течение пяти минут.

После сушки пометьте клетки 100 микролитрами интересующего коктейля вторичных антител в течение 30 минут в увлажненной камере, после чего в течение 10 минут промывайте в TBS. Инкубируйте высушенные предметные стекла, меченные вторичными антителами, со 100 микролитрами интересующего коктейля третичных антител в течение 30 минут, а затем в течение 10 минут промывайте TBS. В конце стирки высушите слайды и закрепите салфетки с помощью монтажного материала, дополненного dapi.

Затем закрепите каждую затворную резинку крышкой и дайте монтажному материалу застыть не менее двух часов. Чтобы отсканировать предметные стекла, откройте программное обеспечение микроскопа и загрузите протокол сканирования изображения. Загрузите первое предметное стекло на предметный столик микроскопа.

Затем в панели управления нажмите «Установить экспозицию» и отрегулируйте время экспозиции для каждого фильтра до тех пор, пока не будет получен достаточный, но не насыщающий сигнал. Нажмите «Пуск» на верхней панели и откройте папку LabID. Введите ID первого слайда и нажмите «Далее».

Чтобы получить обзор предметного стекла в ярком поле света с 4-кратным увеличением, нажмите «Монохромное изображение» и найдите образец. Чтобы выбрать область ткани для сканирования, нажмите клавишу Control и с помощью курсора выберите или отмените выбор областей интереса для сканирования с 4-кратным увеличением. Чтобы получить флуоресцентное красное/синее/зеленое изображение каждой области, нажмите кнопку Low Power imagine.

Для выбора поля высокой мощности нажмите клавишу Control и выберите не менее пяти областей интереса, которые соответствуют областям ткани, которые будут сканироваться с 20-кратным увеличением. Затем, чтобы получить мультиспектральное изображение каждого поля, нажмите кнопку High Power Imagine, а затем нажмите кнопку Хранилище данных, чтобы сохранить изображения в соответствующей папке идентификатора лаборатории. Чтобы создать новый проект, в меню «Файл» выберите «Новый проект», в меню «Найти функцию» выберите «Сегментация ячеек», а в меню «Фенотипизация» выберите «Фенотипизация», а затем нажмите «Настроить».

В поле Формат изображения выберите мультиспектральный. В формате образца выберите флуоресценцию. Чтобы интегрировать репрезентативные изображения в проект, в меню «Файл» нажмите «Открыть изображение» и выберите 10-30 репрезентативных изображений всей серии.

Чтобы удалить автоматическое цветение, откройте неокрашенный слайд и выберите источник библиотеки и соответствующие флуорофоры. Нажмите кнопку «Автоцветение» и выберите область автоматического цветения на пустом слайде. Чтобы создать составное изображение, выберите «Подготовить все», чтобы интегрировать библиотеку флуоресценции и автоматические флуоресцентные спектры.

Нажмите на значок глаза, чтобы открыть панель редактора вида, и снимите флажок автофлуоресценции, чтобы обрезать сигнал автофлуоресценции. Выберите подходящий цвет для каждого маркера. Чтобы сегментировать клетки, в меню отсека выберите ядра и мембрану.

В меню ядер установите DAPI в качестве пятно для счетчика ядер. Щелкните по сегментам клеток и проверьте сегментацию ядер в клеточных мембранах. Чтобы фенотипировать клетки, в меню фенотипа нажмите кнопку Добавить.

Чтобы создать категории клеточного фенотипа, выберите более пяти репрезентативных для комбинации флуорофора и флуорофора и щелкните классификатор обучения. Классификатор создает алгоритм, который атрибутирует фенотип для каждой ячейки с доверительным интервалом. Увеличьте масштаб и проверьте фенотипы клеток.

Затем нажмите «Фенотип все», чтобы сохранить алгоритм фенотипа и проект изображения, в меню «Файл» выберите пункт «Сохранить проект». Затем присвойте проекту имя и сохраните его. Чтобы выполнить пакетный анализ серии, выберите Анализ ванны и выберите сохраненный проект.

Выберите папку для хранения пакетных данных. Добавьте изображения для анализа, затем нажмите «Запустить». В конце анализа проверьте качество составного изображения и проверьте фенотипизацию всех изображений в серии.

Анализ инфильтрирующих опухоль CD8-положительных Т-клеток на образце прозрачной почечно-клеточной карциномы с помощью флуоресцентной мультиспектральной визуализации показывает, что примерно половина CD8-положительных Т-клеток являются одинарно-положительными на PD-1 и около 1/3 – двойноположительными на PD-1 и Tim-3. После интеграции этих различных клеточных сигналов на срезе ткани, измерение интенсивности цветения PD-1 на положительном Tim-3 положительном Tim-3 в сравнении с PD-1-положительными, Tim-3 отрицательными CD8-положительными Т-клетками показывает, что PD-1 MFI выше, когда Tim-3 соэкспрессируется, что усиливает функциональную значимость экспрессии Tim-3. В этом репрезентативном эксперименте 66% пациентов с опухолями почек также были положительными на экспрессию лиганда PD-1 и 100% были положительными на лиганд Tim-3 Galactin-9.

Клиническая оценка опухолевых тканей у пациентов с почечно-клеточной карциномой также продемонстрировала положительную корреляцию между количеством и процентом инфильтрирующих опухоль CD-8-положительных Т-клеток, экспрессирующих PD-1 и Tim-3, и параметрами прогностической оценки, но не PD-1-положительным CD-8, не экспрессирующим Tim-3. Интересно, что пациенты с почечно-клеточной карциномой с CD-8-положительными Т-клетками, экспрессирующими PD1 с и Tim3 выше медианного процента, были более склонны к рецидиву, в то время как экспрессия PD-1 без экспрессии Tim-3 co, как было обнаружено, не коррелировала с рецидивом у пациента. Хотя я пытался провести эту процедуру, важно помнить о том, что фенотип клеток должен быть рассмотрен двумя отдельными исследователями, включая патологоанатома, если это возможно.

После этой процедуры могут быть выполнены другие вопросы, такие как цитометрия, чтобы ответить на дополнительные вопросы о функциональном влиянии собственного фенотипа после стимуляции x-vivo. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области рака к изучению иммунных реакций в пораженных органах.