2.15: Спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР)

1. Подготовка исходного материала для ЯМР

1. Добавьте ~10 мг исходного материала в чистую ЯМР-пробирку.
2. Растворите исходный материал в ~0,7 мл дейтерированного растворителя (пример с CDCl₃). Подходящая высота растворителя для хорошего спектра составляет 4,5-5 см.
3. Аккуратно закройте ЯМР-трубку и напишите на крышке название образца.
4. Осторожно встряхните образец, чтобы убедиться, что весь материал растворился. Следите за тем, чтобы не допустить контакта растворителя с колпачком, который может привести к возможному загрязнению образца.
5. Осторожно вставьте трубку ЯМР в спиннер. После установки в магнит спиннер будет вращаться, чтобы весь образец испытывал однородное магнитное поле. Очистите внешнюю сторону ЯМР-трубки и спиннера 2-пропанолом и лабораторными салфетками, чтобы удалить отпечатки пальцев и грязь.
6. Поместите спиннер в измеритель глубины образца, чтобы убедиться, что дно ЯМР-трубки не вставлено слишком глубоко в зонд ЯМР, так как это может повредить спектрометр. Разные зонды имеют разную глубину выборки, и пользователь должен быть осведомлен о конкретном глубиномере.
7. Поместите образец в ЯМР-спектрометр. Здесь был использован спектрометр Varian 400 МГц, оснащенный автосамплером.
8. После завершения ЯМР-измерения обработайте спектр и присвойте пики в спектре.

2. Приготовление 3 М NaOH и синтез халкона

1. Добавьте 60 мг NaOH в мерную колбу объемом 50 мл.
2. Растворите NaOH, добавив деионизированную воду в половину колбы. Разбавьте раствор еще больше, добавив еще воды до достижения отметки.
3. Добавьте 10 мл этанола в колбу с круглым дном объемом 50 мл, оснащенную магнитной мешалкой.
4. После этого в ту же колбу добавляют 680,5 мг 4-метоксибензальдегида и 5 мл раствора NaOH, приготовленного на шаге 2.1.
5. Затем добавьте 671 мг 4-метилацетофенона в перемешанный раствор, закройте колбу крышкой и перемешайте при комнатной температуре.
6. Контролируйте ход реакции с помощью ¹H ЯМР с интервалом в 30 минут (см. шаг 3) до полного расходования исходных материалов.
7. Добавьте 5 мл воды, когда реакция достигнет завершения (~3 часа). Процедите образовавшийся осадок и промойте его 20 мл этанола 1:2/воды. Дайте осадку высохнуть.
8. Рассчитайте выход полученного продукта. Подготовьте образец ЯМР в соответствии с шагом 1.2.2.7. Проверьте чистоту с помощью ¹H NMR. Если продукт не чистый, очистите его путем рекристаллизации этанолом.
9. Добавьте примерно 3 капли реакционной смеси в ЯМР-пробирку с помощью пипетки Пастера и промойте пипетку дейтерированным растворителем.
10. Повторите шаги 1.2–1.8.

3. Краткая интерпретация спектра ЯМР

1. Обработайте спектр подходящей программой (пример приведен MestReNova).
2. Соотнесите различные пики со сдвигами ЯМР в таблице Таблица 1. Химические сдвиги дают представление о том, в какой среде существуют протоны.
3. Интегрируйте пики, чтобы получить количество атомов водорода, соответствующее каждому пику. Интегрирование всех пиков дает относительное число общих протонов.
4. Оцените расщепление протонных пиков, которые указывают на количество соседей.
5. Измерьте J-связь, чтобы увидеть, как протоны связаны друг с другом.

Спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) является важным методом определения молекулярной структуры и чистоты образцов в органической химии.

В ЯМР-спектроскопии образцы подвергаются воздействию сильного магнитного поля. При воздействии определенные ядра переходят или резонируют между дискретными энергетическими уровнями. Энергетический разрыв между этими уровнями может быть измерен и визуализирован в виде спектров. Эти данные могут быть использованы для выяснения химической структуры образца.

Не все ядра обладают необходимыми свойствами для того, чтобы быть ЯМР-активными. Наиболее распространенными изотопами являются 1H, 2H, 13C, 19F и 31P.

В этом видео мы познакомим вас с принципами ЯМР, рассмотрим примеры подготовки образцов ЯМР на разных стадиях химической реакции и обсудим несколько применений.

В приборе ЯМР жидкий азот и гелий используются для охлаждения сверхпроводящего магнита. Магнит подает на образец постоянное магнитное поле. Внутри образца атомные ядра с нечетным числом протонов и/или нейтронов будут выравниваться либо с полем, принимая низкоэнергетическое состояние, либо против него, принимая высокоэнергетическое состояние.

Разность энергий между двумя уровнями — это резонансная частота, которая зависит от силы приложенного поля и типа ядра. Для магнитов, используемых в ЯМР, значение находится в радиочастотном или радиочастотном диапазоне.

Радиочастотная катушка возбуждает образец радиочастотным импульсом, «переводя ядра с низкой энергией в более высокое состояние», прежде чем вернуться обратно. Катушка обнаруживает эти изменения намагниченности, которые отображаются в виде пиков.

Сила ЯМР заключается в его способности различать ядра, в данном случае водород, по их химическому окружению. Электроны на соседних атомах блокируют или «экранируют» ядра от некоторого магнитного поля. Это эффективное поле изменяет резонансную частоту для конкретных ядер, что называется химическим сдвигом. В этаноле метилен, гидроксил и метилпротоны имеют уникальные резонансные частоты. Определение площади под каждым пиком позволяет выяснить количество протонов каждого типа.

Поскольку приборы с разной магнитной силой будут смещать резонансные частоты, они ссылаются на стандартную молекулу, добавленную в образец, часто тетраметилсилан или ТМС. Химический сдвиг частот очень мал и часто выражается в частях на миллион или ppm.

При использовании сильного магнита с высоким разрешением пики иногда разделяются на субпики. Это вызвано соседними ядрами, некоторые из которых выровнены с магнитным полем, некоторые против него; Дальнейшее изменение эффективного поля, приложенного к ядрам. В этаноле 2 метиленовых протона дважды расщепляют метиленовый пик на триплет, а 3 метиленовых протона трижды расщепляют метиленовый пик на квартет. Расстояние от расщепления, или J-связи, связано с расстоянием до ядер, что способствует качественному открытию.

Теперь, когда вы понимаете основные принципы ЯМР, давайте рассмотрим пример процедуры, в которой протонный ЯМР используется для мониторинга синтеза халкона из альдегида и кетона.

Начните с использования пастеровской пипетки, чтобы добавить небольшое количество исходного материала в стакан. Переместите в вытяжной шкаф и разбавьте исходный материал 0,7 мл дейтерированного растворителя. Используются дейтерированные растворители, так как резонансная частота дейтерия находится за пределами диапазона протонов.

С помощью пастеровской пипетки добавьте 0,7 мл разбавленного исходного материала в чистую 5-миллиметровую ЯМР-пробирку, заполнив дно на 4,5,5 см. Закройте ЯМР-трубку крышкой и наклейте на нее этикетку. Осторожно встряхните пробирку, стараясь не допустить контакта образца с колпачком. Затем вставьте трубку в спиннер.

Очистите внешнюю сторону пробирки и спиннера с помощью 2-пропанола и лабораторных салфеток. Затем поместите образец в узел глубиномера и откалибруйте глубину введения.

После калибровки загрузите сборку образца в ЯМР-спектрометр вручную или с помощью автоматического сэмплера. Наконец, используйте компьютерную рабочую станцию для получения спектра ЯМР.

Сгенерируйте спектры ЯМР с помощью этой процедуры для каждого из исходных материалов реакции. Для синтеза халкона должны быть сгенерированы спектры как метоксибензальдегида, так и метилацетофенона.

Затем выполните синтез образца, соединив исходные материалы и реагенты в колбе, чтобы начать реакцию.

С интервалом в 30 минут удалите небольшую аликвоту реакционной смеси с помощью пастеровской пипетки и добавьте 3 капли в чистую ЯМР-пробирку.

Разбавьте этот сырой продукт реакции дейтерированным растворителем и приготовьте для ЯМР с помощью ранее описанной процедуры.

По мере развития реакции будет образовываться желтый осадок. Когда реакция завершена, промойте и отфильтруйте осадок и сгенерируйте спектры ЯМР для очищенного продукта реакции.

Теперь, когда мы сгенерировали спектры ЯМР на каждой стадии химической реакции, давайте проанализируем их.

Пики спектров ЯМР для каждого из исходных материалов присваиваются различным протонным группам внутри молекулы в соответствии с их химическими сдвигами и количеством протонов, участвующих в каждом пике. Здесь мы выделяем 4 основные протонные группы для метилацетофенона и метоксибензальдегида, отмечая пик альдегида между 9,5 и 10,5 ppm. Сравнивая ЯМР-спектры продуктов реакции сырой нефти в разные моменты времени, выясняется эволюция химической реакции, в результате которой синтезируется халкон. Например, альдегидный пик исходного материала метоксибензальдегида все еще присутствует после 30 мин реакции, но полностью исчезает через 3 ч, что означает завершение реакции.

Исследуя спектр очищенного продукта, мы можем отнести каждый пик к протонной группе в структуре халкона. Например, рассматривая пики 3 и 4, мы видим, что их интегралы равны одному, что соответствует группам, содержащим только один протон.

Пики 3 и 4 – это так называемые дублеты, обозначающие один соседний протон. Оба имеют J-константы связи 16 Гц, что позволяет предположить, что протоны расположены поперек E-двойной связи. Присваивая все пики ЯМР очищенного продукта реакции, мы подтверждаем синтез чистого халкона.

ЯМР-спектроскопия имеет широкий спектр применения и используется во многих научных и медицинских областях.

В этом приложении протонный ЯМР используется для проверки синтеза и структуры как дамидокарбена, так и мононоамидокарбина, спектры ЯМР которых имеют различные паттерны расщепления пиков. Эти карбены также образовывали, казалось бы, различные продукты реакции в сочетании с белым фосфором; DAC1 генерировал ярко-красный продукт реакции, в то время как MAAC2 производил ярко-оранжевый продукт. Эти различия в продуктах реакции были подтверждены с помощью второго применения ЯМР, 31P? ЯМР, который генерирует спектры на основе разницы в резонансной частоте ядер фосфора.

Здесь была использована ядерная магнитно-резонансная томография, или МРТ, для создания анатомической карты мозга и выбора областей мозга, представляющих интерес. Затем с помощью ЯМР-спектроскопии были получены спектры ключевых метаболитов. Наконец, с помощью МРТ были оценены изменения в метаболизме мозга в различных экспериментальных условиях.

В данной заявке ЯМР был использован для анализа связывающих свойств и предложения 3D-структуры медьсвязывающего пептида. Во-первых, спектры ЯМР сравнивались для несвязанного и медносвязанного состояний пептида. Затем, используя более совершенные методы двумерного ЯМР, были оценены различные потенциальные конформации структуры пептида. Наконец, эти структурные ограничения, полученные с помощью ЯМР, были использованы для разработки предложенной трехмерной структуры для несвязанного пептида.

Вы только что посмотрели введение JoVE в ЯМР-анализ. Теперь вы должны понять принципы, лежащие в основе генерации и анализа спектров ЯМР, а также процедуру подготовки образцов для ЯМР.

Спасибо за просмотр!