Методы очистки биомолекул на основе хроматографии
В биохимии методы очистки, основанные на хроматографии, используются для выделения соединений из сложной смеси. Два таких метода, обычно используемых…
В биохимии методы очистки, основанные на хроматографии, используются для выделения соединений из сложной смеси. Два таких метода, обычно используемых биохимиками, — это эксклюзионная хроматография и аффинная хроматография. При эксклюзионной хроматографии колонка, заполненная пористыми шариками, разделяет компоненты смеси в зависимости от размера. С другой стороны, аффинная хроматография позволяет проводить более точное разделение биомолекул с помощью колонки, состоящей из стационарной фазы, содержащей лиганды, специфичные для мишеней.
Это видео служит введением в эксклюзионную и аффинную хроматографию, а также в концепции, которые ими управляют. Описана пошаговая процедура очистки белка, меченного гистидином, с помощью иммобилизованной металлической аффинной хроматографии. Также прослеживается применение обоих этих хроматографических методов в биохимии и биомедицинских исследованиях.
"Хроматография" относится к широкому спектру методов, используемых для выделения компонента из сложной смеси, что является важным этапом перед определением свойств и активности биомолекулы. Каждый хроматографический метод имеет свой механизм разделения, в зависимости от матрицы образца и целевого соединения. В этом видео мы сосредоточимся на принципах и работе двух методов, общих для биохимии: исключения размера и аффинной хроматографии.
Эксклюзионная хроматография или SEC основана на размере соединений в образце. Подвижная фаза, содержащая образец, добавляется в колонку с пористым материалом: неподвижную фазу. Молекулы в образце делятся на 1 из 3 категорий.
Молекулы, слишком большие для проникновения в поры, проходят кратчайшее расстояние через колонку. Любые виды с молекулярной массой выше этого «предела исключения» будут одновременно выходить из колонки. Молекулы, достаточно маленькие, чтобы свободно проникать в поры, будут удерживаться дольше всего, и выйдут из колонки вместе. Молекулярная масса, обеспечивающая полное проникновение в поры, является «пределом проникновения».
Только молекулы между этими пределами будут отделены друг от друга, поскольку они тратят разное количество времени на диффицацию в поры и из них. Более мелкие молекулы дольше удерживаются на колонне, потому что они проводят больше времени в неподвижной фазе, в то время как более крупные молекулы в этих пределах выходят раньше.
Молекулярные массы на 1-2 порядка попадают в эти пределы. Колонки выбираются с учетом этого, или несколько колонок могут использоваться последовательно, если имеется широкий спектр желаемых соединений.
Теперь, когда вы ознакомились с теорией SEC, давайте рассмотрим, как она проводится.
Чтобы начать процедуру SEC, колонку необходимо уравновесить деионизированной водой и хроматографическим буфером. После подготовки буфер с образцом впрыскивается в колонку. Затем буфер проталкивается с низкой скоростью потока. Детектор следит за тем, что выходит из колонки, чтобы определить наличие нужного аналита. Крупные молекулы с молекулярной массой выше предела исключения выходят из колонки одновременно. Мелкие фракции из колонки собираются в пробирки. Каждая фракция проверяется на качество молекулы-мишени с помощью гель-электрофореза или других аналитических методов.
Теперь давайте посмотрим на аффинную хроматографию или АС, один из самых эффективных способов очистки белков. Многие биомолекулы избирательно связываются с определенными лигандами – свойство, которое AC использует путем прилипания лиганда, специфичного к мишени, к стационарной фазе.
Когда смесь протекает через колонку, молекулы-мишени присоединяются к лиганду, а остальные протекают через него. После того, как смесь прошла через колонку, молекула-мишень может быть собрана с помощью одного из двух методов элюирования, основанных на специфичности.
Можно сказать, что биоспецифичность имеет «нормальную» или «обратную роль». При биоспецифическом элюировании нормальной роли добавляется агент, который конкурирует с адгезивным лигандом за связывание с целевой биомолекулой.
При обратном биоспецифическом элюировании агент конкурирует с мишенью за связывание с адгезивным лигандом. Второй тип элюирования, «неспецифический» элюирование, снижает связывание мишени с лигандом путем изменения pH, ионной силы или полярности раствора. Если белок не связывается с лигандом, который может быть иммобилизован, белок может экспрессироваться, содержащим «метку»: короткие пептидные последовательности, сконструированные для связывания с лигандом.
Одной из разновидностей является иммобилизованная аффинная хроматография ионов металлов, сокращенно IMAC, в которой прилипший металлический лиганд, такой как никель или кобальт, связывается с остатками гистидина на модифицированном белке. С помощью методов молекулярной биологии целевые белки генерируются с повторяющимися остатками гистидина, называемыми полигистидиновой меткой, которая связывается с металлом через боковую цепь имидазола на гистидине. После связывания белок может быть собран со свободным имидазолом с помощью обратно-специфического элюирования и позже использован в широком спектре последующих применений. Теперь, когда вы ознакомились с теорией аффинной хроматографии, давайте рассмотрим процедуру IMAC в лаборатории.
В IMAC стационарная фаза может быть добавлена непосредственно к смеси подвижной фазы и образца, что позволяет связывать меченый им белок. Затем эта суспензия заливается в колонну, где несвязанные соединения капают в отходы, в то время как суспензия остается. Емкость для навозной жижи промывают для сбора остатков смолы и пробы, которая добавляется в колонну.
Смола перемешивается, чтобы несвязанные компоненты были сыпучими. Добавленный буфер для стирки помогает смыть их. После того, как все несвязанные компоненты были удалены, отходы заменяются контейнером для сбора целевого белка.
Добавляют буфер, содержащий имидазол, перемешивают и дают отдохнуть, чтобы развязать молекулу-мишень. Имидазол связывается с металлом, заменяя и высвобождая меченый белок. Высвободившийся белок собирают, и этап имидазола повторяют, чтобы обеспечить полный сбор. Для дальнейшей очистки образца перед анализом на образце может быть запущена система SEC.
Теперь, когда мы рассмотрели теорию и процедуру этих двух методов, давайте рассмотрим некоторые способы их применения в биохимической области.
Распространенной причиной очистки белков является изучение их роли в развитии заболеваний. Муковисцидоз вызывается дефектами белка-трансмембранного регулятора проводимости муковисцидоза, или CFTR. После выращивания белка с помощью his-tag в дрожжах как аффинность, так и эксклюзионная хроматография позволяют выделить белок с последующим изучением его функции.
В некоторых случаях присутствие полигистидиновой метки может изменить структуру белка, тем самым влияя на его функцию. Другой распространенной меткой является мальтозосвязывающий белок или MBP, который связывается со связанной амилозой в колонке. Затем мальтоза используется для высвобождения комплекса. Затем MBP может быть расщеплен и удален с помощью SEC для получения чистого желаемого белка.
Вы только что посмотрели видео JoVE об исключении размера и аффинной хроматографии. В нем рассматривалась теория техник, рассматривались общие процедуры и рассматривались некоторые способы их использования.
Спасибо за просмотр!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: How does size-exclusion chromatography separate molecules in a mixture?
Size-exclusion chromatography separates molecules based on their size using a column packed with porous material. Large molecules cannot enter the pores and exit first, while small molecules enter the pores and exit last. Only molecules between the exclusion and permeation limits are separated from one another as they spend varying amounts of time diffusing in and out of the pores.
Q2: What are the three molecular weight categories in size-exclusion chromatography?
Molecules fall into three categories: those above the exclusion limit that cannot enter pores and exit together first; those below the permeation limit that freely enter pores and exit together last; and those between these limits that separate based on varying retention times. Molecular weights across one to two orders of magnitude typically fall within the separation range.
Q3: How does affinity chromatography use ligands to purify target proteins?
Affinity chromatography attaches target-specific ligands to the stationary phase. When a mixture flows through the column, target molecules selectively bind to the ligands while other components pass through. The target protein is then collected through elution methods that either compete with the ligand or change solution conditions like pH or ionic strength.
Q4: What is a polyhistidine tag and how is it used in immobilized metal affinity chromatography?
A polyhistidine tag is a short peptide sequence of repeating histidine residues engineered onto target proteins. In immobilized metal affinity chromatography, these tags bind to adhered metal ligands like nickel or cobalt via the imidazole side chain on histidine. The tagged protein is then released using free imidazole via reverse-role specific elution.
Q5: What steps are involved in the immobilized metal affinity chromatography procedure?
The IMAC procedure involves adding the stationary phase directly to the sample mixture to allow his-tagged protein binding. The slurry is poured into a column where unbound compounds drain to waste. After washing to remove unbound components, imidazole buffer is added to release the target protein by competing with the metal ligand.
Q6: Why might researchers combine size-exclusion and affinity chromatography in protein purification?
Researchers combine these techniques to achieve higher purity levels. After affinity chromatography isolates the target protein using ligand binding, size-exclusion chromatography can further purify the sample by separating based on molecular size. This sequential approach is particularly useful when protein tags like polyhistidine may affect protein structure or function.
Q7: How is gel electrophoresis used to evaluate fractions collected from size-exclusion chromatography?
After fractions are collected from the size-exclusion column, gel electrophoresis and other analytical techniques are used to test the quality and identity of the target molecule in each fraction. This verification step ensures that the desired biomolecule has been successfully isolated and separated from other components in the mixture.