4.7: Двумерный гель-электрофорез

Двумерный гель-электрофорез (2DGE) — это метод, который может растворять тысячи биомолекул из смеси. Этот метод включает в себя два различных метода разделения, которые были связаны друг с другом: изоэлектрическую фокусировку (IEF) и электрофорез в полиакриламидном геле додецилсульфата натрия (SDS-PAGE). Это физически разделяет соединения по двум осям геля по их изоэлектрическим точкам (электрохимическое свойство) и их молекулярной массе.

Процедура, описанная в этом видео, охватывает основные понятия 2DGE и общую процедуру определения характеристик состава сложного белкового раствора. В разделе «Применение» показаны три примера этого метода, включая обнаружение биомаркеров для начала и прогрессирования заболевания, мониторинг лечения у пациентов и изучение белков после посттрансляционной модификации (ПТМ).

Двумерный, или 2D, гель-электрофорез — это метод, использующий два различных метода разделения, которые могут отделить тысячи белков от одной смеси. Один из методов, SDS-PAGE или электрофорез в полиакриламидном геле додецилсульфата натрия, не может полностью разделить сложные смеси в одиночку. Двухмерный гель-электрофорез связывает SDS-PAGE со вторым методом, изоэлектрической фокусировкой или IEF, который разделяет на основе изоэлектрических точек, что позволяет потенциально разрешать все белки в лизате клетки. В этом видео будут показаны принципы 2D-гель-электрофореза, общая процедура и некоторые из ее биомедицинских применений.

2D гель-электрофорез начинается с IEF в качестве первого измерения. Каждый белок имеет значение pH, называемое изоэлектрической точкой или pI, где суммарный заряд равен нулю. Когда белок подвергается воздействию электрического поля, он будет двигаться к электроду с противоположным зарядом. Представляющие интерес образцы загружаются на иммобилизованные полоски с градиентом pH, или IPG, в которые встроены амфолиты, молекулы, содержащие как кислотные, так и основные группы. Затем электрическое поле прикладывается к полоске градиента pH, заставляя белки мигрировать до тех пор, пока они не достигнут значения pH, соответствующего их pI, где они теряют свой суммарный заряд.

Перед запуском второго измерения встроенные белки обрабатываются SDS, денатурируя их и обеспечивая равномерный отрицательный заряд. После этого полоски IPG помещаются на полиакриламидный гель. Приложенное электрическое поле притягивает белки к аноду, при этом более крупные белки медленнее продвигаются через гель.

После того, как белковая смесь была разделена в соответствии с pI и молекулярной массой, карта протеома визуализируется с помощью красителей, и идентифицируются белки, представляющие интерес.

Теперь, когда мы рассмотрели принципы 2D-гель-электрофореза, давайте рассмотрим типичную лабораторную процедуру.

Перед проведением эксперимента белки должны быть солюбилизированы в среду. Солюбилизация образца достигается путем деагрегирования белков комбинацией хаотропных агентов для нарушения водород-связывающих взаимодействий, неионогенных детергенов для предотвращения изменения заряда белков, восстановителей для разрыва дисульфидных связей и буферов. Для удаления мешающих обильных белков и других молекул материал последовательно экстрагируется центрифугированием и сбором полученной гранулы; за этим следует лечение эндонуклеазой, ферментом, используемым для поглощения любой ДНК, которая может помешать эксперименту.

После того, как белки растворятся, полоски IPG готовят путем промывки раствором для чистки полосок и оставляют в перевернутом виде для высыхания. Затем каждой полосе присваивается номер держателя полосы. После готовности клеточный экстракт загружается на полоски медленным, скользящим движением от отрицательного к положительному концу. С целью регидратации на электрод и под гелевые полоски кладут влажную промокательную бумагу; затем полосы IPG накладываются на прибор IEF. Подается сильный электрический ток, и белки начинают мигрировать.

После завершения первого измерения гель для SDS-PAGE подготавливается в литейном аппарате. Полоски IPG обрабатываются путем помещения их лицевой стороной вниз в буфер уравновешивания, содержащий SDS. Блок электрофореза подготавливается с добавлением буфера для электрофореза. Обработанные полоски IPG собираются с помощью пинцета, помещаются поверх гелевых пластин и запечатываются агарозным герметизирующим раствором. Затем источник напряжения подает электрическое поле, которое удерживается до тех пор, пока самые быстро движущиеся белки не окажутся на расстоянии 1 см от дна геля.

После завершения электрофореза белки необходимо визуализировать. Традиционно это выполняется путем окрашивания синим или серебряным нитратом Кумасси. Представляющие интерес белки могут быть перенесены из геля и проанализированы с помощью вестерн-блоттинга.

Второй подход к идентификации включает в себя извлечение белков из геля, их расщепление, а затем анализ с помощью масс-спектрометрии.

Теперь, когда мы рассмотрели процедуру, давайте рассмотрим некоторые варианты использования 2D-гель-электрофореза.

Одним из наиболее распространенных применений этого метода является идентификация молекул, участвующих в инициации и прогрессировании заболевания. Двухмерный гель-электрофорез в сочетании с масс-спектрометрией может обнаружить повышение или понижение регуляции определенных белков в пораженных участках по сравнению со здоровыми.

Кроме того, 2D гель-электрофорез полезен для отслеживания развития реакции пациента на потенциальный терапевтический препарат. Образцы могут быть взяты у пациентов в различные моменты времени после начала лечения. Таким образом, 2D-гель-электрофорез в сочетании с вестерн-блоттингом или масс-спектрометрическим анализом может обнаруживать белки, связанные с негативными реакциями, такими как воспаление; или отсутствие белков в облегченном состоянии.

Еще одно применение 2D-гель-электрофореза заключается в изучении структуры и функции белка после посттрансляционной модификации, или ПТМ, которые являются добавками к белкам после их трансляции из мРНК. ПТМ могут регулировать различные функции, включая передачу сигналов белков, экспрессию генов или вызывать окислительное повреждение. 2D-гель-электрофорез чувствителен к модификациям, таким как метилирование или ацетилирование, которые могут вызвать сдвиг как pI, так и молекулярной массы.

Вы только что посмотрели видео JoVE о 2D-гель-электрофорезе. В этом видео описаны принципы работы методики, типичная экспериментальная процедура и несколько ее применений в области биомедицины.

Спасибо за просмотр!