Кристаллизация белка, получение твердой решетки биомолекул, выясняет структуру белка и дает возможность изучения функции белка. Кристаллизация включает в себя сушку очищенного белка под воздействием многих факторов, включая pH, температуру, ионную силу и концентрацию белка. После получения кристаллов структура белка может быть прояснена с помощью рентгеновской дифракции и вычисления модели электронной плотности.
В этом видео представлена кристаллизация белка и показана общая процедура. В процедуре рассматриваются экспрессия и очистка белков, кристаллизация и рентгеновская дифракция. Применение кристаллизации белка включает в себя in silico разработку лекарств, определение сайта связывания и анализ структуры мембранного белка.
Кристаллизация белка, получение твердой решетки биомолекул, выясняет структуру белка и дает возможность изучения функции белка. Кристаллизация включает в себя сушку очищенного белка под воздействием многих факторов, включая pH, температуру, ионную силу и концентрацию белка. После получения кристаллов структура белка может быть прояснена с помощью рентгеновской дифракции и вычисления модели электронной плотности.
В этом видео представлена кристаллизация белка и показана общая процедура. В процедуре рассматриваются экспрессия и очистка белков, кристаллизация и рентгеновская дифракция. Применение кристаллизации белка включает в себя in silico разработку лекарств, определение сайта связывания и анализ структуры мембранного белка.
Кристаллизация белка — это процесс получения решетчатой твердой формы белка. Эти кристаллы особенно ценны для структурных биологов, помогая в изучении функции белка. Другие методы, такие как масс-спецификация или SDS-PAGE, могут предоставить только информацию об одномерной структуре белков. Кристаллизация белка дополняется методами рекомбинантной экспрессии белка и рентгеновской дифракции. В этом видео будут показаны принципы кристаллизации белка, общая лабораторная процедура и несколько ее применений в биохимической области.
Первым этапом, необходимым в этом процессе, является получение миллиграммовых количеств очень чистого белка, обычно с использованием экспрессии рекомбинантного белка. Ген, соответствующий представляющему интерес белку, клонируют в экспрессирующий вектор, а экспрессированный белок сливают с аффинной меткой, такой как полигистидин, чтобы помочь в очистке с помощью аффинной хроматографии. Чтобы узнать больше, посмотрите видео об аффинной хроматографии из этой коллекции.
Образование очищенного белка в кристаллы зависит от правильного сочетания многих факторов, включая pH, ионную силу, концентрацию осадителя и белка, температуру и скорость уравновешивания. Наиболее распространенным используемым методом является диффузия пара, из которых можно выделить две категории: висячая капля и сидячая капля. Капля, содержащая чистый белок, буфер и осадок, который представляет собой ионное твердое вещество, связывающее молекулы воды, снижая доступность воды для белка и имитируя более высокую концентрацию белка, находится в закрытой микролунке с резервуаром с более высококонцентрированной смесью того же буфера и осадителя. Вначале концентрации белка и осадка слишком низки, чтобы вызвать кристаллизацию. В ходе эксперимента вода испаряется из капли и собирается в резервуаре; Уменьшение количества воды в капле приводит к тому, что система становится перенасыщенной, и может произойти зарождение с последующей кристаллизацией. Чистый перенос воды из капли находится в равновесии, и система поддерживается до тех пор, пока процесс не завершится.
Для визуализации 3D-структуры используется рентгеновская дифракция. Чтобы получить рентгеновские данные от кристалла, его помещают в монохроматический рентгеновский пучок, где он подвергается воздействию луча под всеми углами. Каждая экспозиция дает изображение, где каждое пятно представляет собой дифрагированное рентгеновское излучение, которое выходит из кристалла и регистрируется детектором. Данные объединяются для создания модели расположения атомов внутри кристалла. Полученная кристаллическая структура демонстрирует трехмерное расположение атомов с типичным разрешением 2 ангстрема.
Теперь, когда мы рассмотрели принципы кристаллизации белка, давайте рассмотрим обобщенный протокол.
Чтобы начать процедуру, вектор экспрессии, содержащий интересующий ген, трансформируется в клетки. Клетки инкубируются, и в середине логарифмической фазы экспрессия инициируется добавлением индуктора, такого как IPTG, который запускает транскрипцию мРНК гена. После экспрессии белка сырой материал суспендируют в буфере для лизиса, а затем осветляют центрифугированием.
Затем осветленный лизат загружается в никелевую колонку, и белок, помеченный полигистидином, связывается с колонкой, в то время как все остальные биомолекулы смываются.
После того, как получено несколько миллиграммов чистого белка, он готов к кристаллизации путем диффузии пара. 24-луночный подвесной/сидячий поддон заполнен буферными растворами хлорида натрия и ацетата натрия в различных концентрациях. Для метода сидячей капли равные объемы белка и резервуарного раствора пипетируются на полку над каждой лункой, а затем лоток накрывается прозрачной лентой. Затем лоток помещают в инкубационную камеру, и лунки контролируются на предмет роста на следующий день, а затем каждые несколько дней.
Как только подходящий кристалл получен, он готов к рентгеноструктурному анализу. Кристалл устанавливается на гониометр для позиционирования кристалла в выбранных ориентациях. Кристалл освещается монохроматическим пучком рентгеновских лучей под всеми углами, создавая дифракционную картину. Программное обеспечение преобразует двумерные изображения, полученные в различных ориентациях, в трехмерную модель плотности электронов внутри кристалла, определяя положения атомов в кристалле.
Теперь, когда мы рассмотрели процедуру, давайте рассмотрим некоторые полезные применения кристаллизации белка и другой метод кристаллизации.
Кристаллизация белка может быть использована для разработки лекарственных препаратов in silico. Трехмерная структура основного белка полимеразы 2 вируса гриппа, который был связан с вирусной инфекцией у млекопитающих, была определена путем кристаллизации и рентгеновской дифракции. Потенциальные сайты связывания в белке визуализированы, и с помощью программы докинга была сконструирована трехмерная молекула, которая будет вставляться в расщелину белка.
Сокристаллизация комплексов белок-ДНК также является полезным методом. ДНК-связывающие белки модулируют широкий спектр биологических функций, таких как транскрипция и полимеризация ДНК и репарация ДНК; А кристаллические структуры этих комплексов могут дать представление о функции белка, механизме и природе конкретного взаимодействия. Белок E. coli SeqA, отрицательный регулятор репликации ДНК, был сокристаллизован с гемиметилированной ДНК.
Интегральные мембранные белки, такие как рецепторы, сопряженные с G-белком, или GCPR, трудно кристаллизовать из-за их ограниченной площади полярной поверхности, доступной для формирования контактов кристаллической решетки, что привело к развитию кристаллизации белков с помощью слияния белков. Гены, кодирующие β2 адренергический рецептор, GCPR и лизоцим, были вставлены в вектор экспрессии. Кристаллизация гибридного белка β2AR-лизоцима была достигнута за счет увеличения внеклеточной гидрофильной поверхности над естественно гидрофобной β2AR, обеспечиваемой лизоцимом, необходимой для формирования упаковочных взаимодействий в кристаллической решетке.
Вы только что посмотрели видео JoVE о кристаллизации белка. В этом видео описаны его принципы, обобщенный протокол и некоторые варианты его использования в биомедицинской сфере. Спасибо за просмотр!
Кристаллизация белка, получение твердой решетки биомолекул, выясняет структуру белка и дает возможность изучения функции белка. Кристаллизация включает в себя сушку очищенного белка под воздействием многих факторов, включая pH, температуру, ионную силу и концентрацию белка. После получения кристаллов структура белка может быть прояснена с помощью рентгеновской дифракции и вычисления модели электронной плотности.
В этом видео представлена кристаллизация белка и показана общая процедура. В процедуре рассматриваются экспрессия и очистка белков, кристаллизация и рентгеновская дифракция. Применение кристаллизации белка включает в себя in silico разработку лекарств, определение сайта связывания и анализ структуры мембранного белка.
Кристаллизация белка — это процесс получения решетчатой твердой формы белка. Эти кристаллы особенно ценны для структурных биологов, помогая в изучении функции белка. Другие методы, такие как масс-спецификация или SDS-PAGE, могут предоставить только информацию об одномерной структуре белков. Кристаллизация белка дополняется методами рекомбинантной экспрессии белка и рентгеновской дифракции. В этом видео будут показаны принципы кристаллизации белка, общая лабораторная процедура и несколько ее применений в биохимической области.
Первым этапом, необходимым в этом процессе, является получение миллиграммовых количеств очень чистого белка, обычно с использованием экспрессии рекомбинантного белка. Ген, соответствующий представляющему интерес белку, клонируют в экспрессирующий вектор, а экспрессированный белок сливают с аффинной меткой, такой как полигистидин, чтобы помочь в очистке с помощью аффинной хроматографии. Чтобы узнать больше, посмотрите видео об аффинной хроматографии из этой коллекции.
Образование очищенного белка в кристаллы зависит от правильного сочетания многих факторов, включая pH, ионную силу, концентрацию осадителя и белка, температуру и скорость уравновешивания. Наиболее распространенным используемым методом является диффузия пара, из которых можно выделить две категории: висячая капля и сидячая капля. Капля, содержащая чистый белок, буфер и осадок, который представляет собой ионное твердое вещество, связывающее молекулы воды, снижая доступность воды для белка и имитируя более высокую концентрацию белка, находится в закрытой микролунке с резервуаром с более высококонцентрированной смесью того же буфера и осадителя. Вначале концентрации белка и осадка слишком низки, чтобы вызвать кристаллизацию. В ходе эксперимента вода испаряется из капли и собирается в резервуаре; Уменьшение количества воды в капле приводит к тому, что система становится перенасыщенной, и может произойти зарождение с последующей кристаллизацией. Чистый перенос воды из капли находится в равновесии, и система поддерживается до тех пор, пока процесс не завершится.
Для визуализации 3D-структуры используется рентгеновская дифракция. Чтобы получить рентгеновские данные от кристалла, его помещают в монохроматический рентгеновский пучок, где он подвергается воздействию луча под всеми углами. Каждая экспозиция дает изображение, где каждое пятно представляет собой дифрагированное рентгеновское излучение, которое выходит из кристалла и регистрируется детектором. Данные объединяются для создания модели расположения атомов внутри кристалла. Полученная кристаллическая структура демонстрирует трехмерное расположение атомов с типичным разрешением 2 ангстрема.
Теперь, когда мы рассмотрели принципы кристаллизации белка, давайте рассмотрим обобщенный протокол.
Чтобы начать процедуру, вектор экспрессии, содержащий интересующий ген, трансформируется в клетки. Клетки инкубируются, и в середине логарифмической фазы экспрессия инициируется добавлением индуктора, такого как IPTG, который запускает транскрипцию мРНК гена. После экспрессии белка сырой материал суспендируют в буфере для лизиса, а затем осветляют центрифугированием.
Затем осветленный лизат загружается в никелевую колонку, и белок, помеченный полигистидином, связывается с колонкой, в то время как все остальные биомолекулы смываются.
После того, как получено несколько миллиграммов чистого белка, он готов к кристаллизации путем диффузии пара. 24-луночный подвесной/сидячий поддон заполнен буферными растворами хлорида натрия и ацетата натрия в различных концентрациях. Для метода сидячей капли равные объемы белка и резервуарного раствора пипетируются на полку над каждой лункой, а затем лоток накрывается прозрачной лентой. Затем лоток помещают в инкубационную камеру, и лунки контролируются на предмет роста на следующий день, а затем каждые несколько дней.
Как только подходящий кристалл получен, он готов к рентгеноструктурному анализу. Кристалл устанавливается на гониометр для позиционирования кристалла в выбранных ориентациях. Кристалл освещается монохроматическим пучком рентгеновских лучей под всеми углами, создавая дифракционную картину. Программное обеспечение преобразует двумерные изображения, полученные в различных ориентациях, в трехмерную модель плотности электронов внутри кристалла, определяя положения атомов в кристалле.
Теперь, когда мы рассмотрели процедуру, давайте рассмотрим некоторые полезные применения кристаллизации белка и другой метод кристаллизации.
Кристаллизация белка может быть использована для разработки лекарственных препаратов in silico. Трехмерная структура основного белка полимеразы 2 вируса гриппа, который был связан с вирусной инфекцией у млекопитающих, была определена путем кристаллизации и рентгеновской дифракции. Потенциальные сайты связывания в белке визуализированы, и с помощью программы докинга была сконструирована трехмерная молекула, которая будет вставляться в расщелину белка.
Сокристаллизация комплексов белок-ДНК также является полезным методом. ДНК-связывающие белки модулируют широкий спектр биологических функций, таких как транскрипция и полимеризация ДНК и репарация ДНК; А кристаллические структуры этих комплексов могут дать представление о функции белка, механизме и природе конкретного взаимодействия. Белок E. coli SeqA, отрицательный регулятор репликации ДНК, был сокристаллизован с гемиметилированной ДНК.
Интегральные мембранные белки, такие как рецепторы, сопряженные с G-белком, или GCPR, трудно кристаллизовать из-за их ограниченной площади полярной поверхности, доступной для формирования контактов кристаллической решетки, что привело к развитию кристаллизации белков с помощью слияния белков. Гены, кодирующие адренергический рецептор ?2, GCPR и лизоцим, были вставлены в вектор экспрессии. Кристаллизация белка слияния ?2AR-лизоцима была достигнута за счет увеличенной внеклеточной гидрофильной поверхности над естественно гидрофобной ?2AR, обеспечиваемой лизоцимом, необходимой для формирования упаковочных взаимодействий в кристаллической решетке.
Вы только что посмотрели видео JoVE о кристаллизации белка. В этом видео описаны его принципы, обобщенный протокол и некоторые варианты его использования в биомедицинской сфере. Спасибо за просмотр!
Chapters in this video
0:00
Overview
0:50
Principles of Protein Crystallization
3:16
Protocol for Protein Expression, Crystallization, and X-Ray Diffraction
5:15
Applications
7:20
Summary
Videos from this collection: