Измерения деформируемости и неоднородность эритроцитов в крови, Ektacytometry

Общая цель этого метода заключается в измерении деформируемости эритроцитов и клеточной гетерогенности с помощью эктацитометрии. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы эктацитометрии, такие как насколько деформируемы эритроциты, насколько неоднороден образец крови и как эксперимент меняется в зависимости от заболевания. Основными преимуществами данной методики являются доступность, удобство и надежность при измерении деформируемости и гетерогенности популяций эритроцитов.

Методики могут быть полезны для мониторинга ответа на терапию у пациентов с серповидноклеточной анемией. Потому что деформируемость и гетерогенность эритроцитов коррелируют с составом и концентрацией гемоглобина. Эти методы могут быть применены при других заболеваниях, характеризующихся сниженной деформируемостью эритроцитов, таких как диабет, где снижение деформируемости эритроцитов может способствовать микрососудистым заболеваниям.

Начните с подключения нулевой осмолярной трубки к низкоосмолярному раствору PVP, а 500-осмолярной трубке — к высокоосмолярному раствору PVP. Следите за тем, чтобы боб был полностью опущен в чашку. Запустите программное обеспечение и подготовьте машину, выбрав Hardware Check (Проверка оборудования), а затем инструментируйте ввод-вывод. Дайте инструменту завершить цикл грунтовки.

Как только цикл будет завершен, выньте боб из чашки и полностью вытрите боб и чашку салфеткой для чистки с низким содержанием ворса. Аккуратно перемешайте свежевзятый образец цельной крови, несколько раз перевернув флакон. Затем пипеткой намочите 25 микролитров цельной крови в пяти миллилитрах изоосмолярного раствора PVP.

Укупорив флакон, аккуратно перемешайте, еще раз перевернув несколько раз. Выберите «Деформируемость» в главном меню программного обеспечения, затем создайте новый анализ и добавьте детали эксперимента. Затем поднимите крышку эктацитометра и убедитесь, что боб полностью опущен в чашку и что чашка поворачивается.

Нанесите пипеткой один миллилитр раствора крови PVP в пространство между чашкой и бобом. Затем слегка приподнимите боб, чтобы опустить образец вниз. Дождитесь, пока все пузырьки выйдут из раствора, после чего закройте крышку на эктацитометре.

Отрегулируйте усиление до 200, перемещая стрелку вдоль полосы прокрутки в программном обеспечении. Когда температура стабилизируется на уровне 37 градусов по Цельсию, а дифракционное изображение стабильно, нажмите «Пуск». Наблюдайте за дифракционными картинами по мере сбора данных, чтобы убедиться, что они остаются круглыми, эллиптическими или ромбовидными.

Когда сбор данных будет завершен, распечатайте отчет и очистите его. Дифракционная картина, полученная из здоровой крови в ответ на напряжение сдвига, показывает ожидаемую эллиптическую картину. Индекс относительного удлинения рассчитывается с помощью приведенного здесь уравнения.

Когда образец будет отсаснут, промойте пространство между чашкой и бобом, распыляя деионизированную воду в пространство, пока прибор остается в чистом цикле. После завершения цикла очистки выньте боб из чашки и полностью вытрите боб и чашку салфеткой для чистки с низким содержанием ворса. Правильная сушка имеет решающее значение, так как остаточная вода будет лизировать эритроциты, создавая помехи.

Выберите «Экспорт», чтобы сохранить отчет. Наконец, нажмите на кнопку главного меню в программном обеспечении, чтобы вернуться на главную страницу. После загрузки еще одного образца в эктацитометр, как и раньше, убедитесь в наличии на экране стабильного дифракционного изображения.

Отрегулируйте усиление камеры, перемещая линейку вдоль экрана до тех пор, пока высота дифракции не составит 3,8 см. Используйте линейку, чтобы проверить высоту изображения на экране компьютера. Затем нажмите «Пуск» и наблюдайте за получением данных, как и раньше.

На этом изображении показана дифракционная картина размером 3,8 см, полученная из крови пациента с серповидноклеточной анемией. После очистки эктацитометра, как показано ранее, повторите процедуру для получения дифракционных картин на высоте 4,5 см и 5,4 см. Искажение дифракционной картины происходит в гетерогенных образцах крови, потому что жесткие эритроциты не выравниваются должным образом с деформируемыми клетками, что приводит к ромбовидной дифракционной картине.

Эта картина искажений становится все более заметной по мере того, как усиление камеры корректируется для создания более крупных дифракционных картин. Для осмотической градиентной эктацитометрии начните с добавления 250 микролитров цельной крови во флакон, содержащий пять миллилитров изоосмолярного ПВП, и аккуратно перемешайте. Выберите Osmoscan в главном меню в программном обеспечении.

Затем поместите флакон с раствором крови PVP под иглу с левой стороны аппарата. Опустите иглу до тех пор, пока она не коснется дна флакона. Убедитесь, что трубки правильно подключены к низко- и высокоосмолярным растворам для градиентного производства.

Закройте крышку эктацитометра и откройте дверцу в нижней половине, чтобы обеспечить обзор крови, поступающей в трубку. Нажмите кнопку Новый анализ и введите сведения об эксперименте. Отрегулировав усиление камеры на 200, дайте аппарату работать до тех пор, пока кровь не попадет в чашку из трубки под прибором.

Когда на экране компьютера появится стабильная дифракционная картина, начните сбор данных, нажав кнопку «Начать сейчас» в диалоговом окне. Позвольте эктацитометру получить данные примерно до 500 миллиосмолей на килограмм, а затем остановите прибор. Распечатайте отчет.

Затем снимите старый флакон с кровью PVP и замените его чистым флаконом, содержащим деионизированную воду. Опустите иглу вниз так, чтобы она касалась дна флакона, затем нажмите кнопку полоскания в диалоговом окне, чтобы промыть градиентную систему. После завершения промывки нажмите кнопку «Очистить» в диалоговом окне на мониторе компьютера и выберите «Экспорт», чтобы сохранить отчет.

Высушите боб и чашку, как и раньше. Однородные популяции крови, обнаруженные у здоровых добровольцев, не дают различных кривых деформации при измерении дифракционных размеров. Напротив, гетерогенные популяции крови, такие как кровь пациентов с серповидноклеточной анемией, демонстрируют значительное снижение показателей деформируемости в зависимости от размера дифракционной картины.

При серповидно-серповидной форме, когда степень искажения дифракционной картины измеряется как функция EI max, она коррелирует с гемоглобином S и взрослой формой гемоглобина — гемоглобином A2. Переливание корректирует искажение, на что указывает его обратная зависимость с процентом нормального гемоглобина взрослого человека в крови. Независимо от того, измеряется ли степень искажения дифракционной картины как функция напряжения сдвига, необходимого для достижения половины максимальной деформируемости, или как функция EI max, она коррелирует с фетальным гемоглобином. Ключевые параметры осмотической градиентной эктацитометрии, такие как EI max, EI min и O min, предоставляют дополнительную информацию о клеточной гидратации, соотношении поверхности к объему и осмотической хрупкости соответственно.

После освоения эти техники можно выполнить примерно за час, если они выполнены правильно. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как микроскопия, чтобы ответить на дополнительные вопросы, касающиеся деформируемости отдельных эритроцитов. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как измерить деформируемость и гетерогенность сыворотки в образцах крови.