Доклинические мыши модель остеосаркома определить внеклеточного везикул опосредованной коммуникации между опухоли и мезенхимальных стволовых клеток

Общей целью этой экспериментальной процедуры является разработка доклинической мышиной модели для изучения роли внеклеточной везикул-опосредованной коммуникации между опухолевыми и мезенхимальными стволовыми клетками. Этот метод может помочь ответить на несколько ключевых вопросов в области биологии рака, а именно, как опухолевые и мезенхимальные стволовые клетки взаимодействуют с помощью внеклеточных везикул и способствует ли это прогрессированию рака. Основное преимущество данной методики заключается в том, что она позволяет изучить роль адаптации мезенхимальных стволовых клеток раковыми ВВ в прогрессирование и формирование метастазов in vivo.

Последствия этой процедуры распространяются на нашу терапию рака, потому что мы можем использовать GSA для вмешательства в коммуникацию EV и передачу сигналов андрогенов для подавления прогрессирования рака. Помимо того, что этот метод дает представление о EV-опосредованной коммуникации при остеосаркоме, он также может быть применен ко многим другим типам рака. Действительно, костный мозг, полученный из мезенхимальных стволовых клеток, легко рекрутируется в большее количество участков, где он может дифференцироваться в клетки, поддерживающие рак.

Начните с посева восьми колб площадью 175 квадратных сантиметров с 3 миллионами ячеек 143B каждая. Культивируют клетки с использованием среды, обедненной EV, в течение 36–48 часов. Когда клетки слились на 80-90%, соберите надосадочную жидкость из восьми колб для выделения EV.

Затем используйте дифференциальное центрифугирование, чтобы удалить все клетки и клеточный мусор из надосадочной жидкости. Он состоит из повторяющихся центрифугирований при четырех градусах Цельсия с максимальным ускорением и замедлением. После каждого этапа центрифугирования собирайте надосадочную жидкость и оставляйте один миллилитр надосадочной жидкости в центрифужной пробирке.

Теперь загрузите предварительно очищенную надосадочную жидкость в ультрацентрифужные пробирки по 38,5 миллилитров на пробирку. Затем изолируйте электромобили с помощью ультрацентрифуги при плотности 70 000 г в течение одного часа, с медленным перерывом и при четырех градусах Цельсия. После ультрацентрифугирования осторожно удалите надосадочную жидкость, оставив после себя около одного миллилитра.

Затем повторно суспендируйте EV-содержащие гранулы в оставшемся объеме. Объедините все суспензии. А скопившиеся суспензии промыть PBS.

Заполните тюбик до 38,5 миллилитров. Затем повторите цикл ультрацентрифугирования, но без перерыва. Ротор должен перестать вращаться примерно через час.

Далее аккуратно удалите надосадочную жидкость, не потревожив гранулы, и оставьте от 100 до 200 микролитров раствора. Наконец, повторно суспендируйте гранулу EV и отрегулируйте окончательный объем до 200 микролитров с помощью PBS. Затем ВВ могут быть охарактеризованы ПЭМ, помечены красителями для экспериментов по поглощению или использованы для обучения мезенхимальных стволовых клеток для экспериментов in vivo.

Крайне важно, чтобы первичные МСК имели правильную плотность клеток до контакта с раковыми ВВ. Клетка должна быть слита примерно на 70% для достижения оптимального соотношения EV клетки, а также для предотвращения чрезмерного роста в периоды обучения. В этом эксперименте используются акклиматизированные взрослые мыши Athymic Nude-Foxn1nu.

За день до хирургического вмешательства дайте парацетамол с питьевой водой. В день операции подготовьте клетки 143B по концентрации 200 000 на микролитр в PBS. За 20 минут до операции дайте животному бупренорфин.

Непосредственно перед анестезией загрузите в шприц объемом 10 микролитров концентрированные клетки 143B. После подтверждения правильности анестезии и нанесения глазной мази расположите животное на спине задними лапами по направлению к оператору. Затем закрепите на животном маску для анестезии.

Затем согните левое колено и протрите кожу тремя чередующимися скрабами из 70% этанола и повидон-йода, а затем нанесите 2% лидокаин в качестве местного анальгетика. Теперь сделайте небольшой разрез на коже чуть ниже колена, чтобы обнажить большеберцовую кость. Затем с помощью микроспирального сверла 0,8 миллиметровика сделайте отверстие в большеберцовой кости, примерно на 2 миллиметра ниже колена.

Избегайте сверления отверстий через кортикальные отверстия обеих большеберцовых костей. Медленно вводите один микролитр клеток в отверстие в течение примерно пяти секунд. Затем закройте отверстие каплей тканевого клея, чтобы предотвратить обратный поток суспензии.

Завершите операцию, закрыв кожу швами и одной каплей тканевого клея. Дайте животному восстановиться с помощью подогрева и обрабатывайте его парацетамолом в течение 24 часов. Через два дня с помощью 0,5-миллиметрового инсулинового шприца введите МСК в хвостовую вену.

Правильное введение во время инъекции в хвостовую вену может быть подтверждено визуально. Если появляется белая область или если вы столкнулись с резистентностью, сделайте повторную инъекцию в область, расположенную выше места предыдущей инъекции. Затем два раза в неделю следите за ростом опухоли с помощью биолюминесценции.

Введите мышам D-люциферин через инсулиновый шприц, а через 10 минут измерьте поток фотонов, генерируемый опухолевыми клетками, с помощью системы визуализации. Когда диаметр опухоли животного становится больше 15 миллиметров, или его потеря веса превышает 15%, усыпите животное и соберите все соответствующие ткани. За 10 минут до эвтаназии введите D-люциферин, как это было сделано перед визуализацией.

После эвтаназии соберите легкие, печень, селезенку и почки, используя стерилизованные ножницы и пинцет. Смойте кровь из органов с помощью PBS, и разложите их на чашке Петри для визуализации. С помощью системы биолюминесцентной визуализации задокументируйте обе стороны органов.

Как только снимки будут сделаны, немедленно зафиксируйте органы для будущего гистологического анализа. Чтобы обработать документы с фотографиями, просто примените ручное пороговое значение и подсчитайте количество узелков на каждой фотографии. Обязательно используйте один и тот же порог для каждой фотографии и документируйте ткани со всех сторон, особенно из легких.

После декальцинации большеберцовой кости мыши приступайте к обезвоживанию и заделке парафина. Затем с помощью микротома приготовьте шестимикронные парафиновые срезы и соберите срезы на стеклянных предметных стеклах. Как только предметные стекла высохнут, храните их в течение ночи при комнатной температуре.

На следующий день проведите тепловое извлечение антигена, используя цитратный буфер. Затем окрасьте ткани антителами против GFP в диапазоне от одного до 900, а затем нанесите противодействие DAPI. Наконец, задокументируйте окрашенные срезы тканей с помощью флуоресцентной микроскопии.

Чистота выделенных ВВ подтверждена методом электронной микроскопии. Препараты содержали везикулы диаметром от 40 до 100 нанометров. Чтобы оценить, взаимодействуют ли раковые ВВ с МСК, их помечали зеленым флуоресцентным липофильным линкерным красителем и инкубировали в течение ночи с МСК.

Таким образом, было подтверждено эффективное использование электромобилей MSC. Иммуномодулирующее свойство ВВ на МСК подтверждено с помощью мультиплексного иммуноферментного анализа на основе цитокинов на основе В. Опухолевые ВВ вызывали повышенную продукцию IL-8 и IL-6 в МСК по сравнению с контрольными ВВ фибробластов человека.

Далее, в мышиной модели остеосаркомы, основанной на ортотопическом ксенотрансплантате, было показано, что у мышей, получавших МСК, обученных EV, наблюдался ускоренный рост опухоли. Через четыре дня после системного введения GFP-экспрессирующих МСК в костном мозге и в опухолевой ткани были обнаружены GFP-экспрессирующие клетки, демонстрирующие хоуминг МСК к опухолевому участку. Визуализация различных органов ex vivo выявила образование узелков в легких.

В конечном счете, у мышей, получавших МСК с образованием ВВ, было больше метастазов в легкие. После просмотра этого видео вы должны иметь хорошее представление о том, как обучать стромальные клетки с раковыми EVs ex vivo, а также изучать эффекты обученных стромальных клеток in vivo с использованием доклинических мышиных моделей. После освоения эта процедура может быть выполнена в течение четырех недель, при условии, что имеется достаточное количество раковых ВВ.

При попытке проведения этой процедуры важно заранее спланировать и получить воспроизводимое очищение раковых внеклеточных везикул, а также использовать низкопроходящие пролиферирующие мезенхимальные стволовые клетки.