Улучшена визуализация метастазов в легких на одной резолюции сотовый у мышей, комбинированные В месте Перфузии легочной ткани и X-Gal Окрашивание LacZ-Меткой опухолевых клеток

Общая цель этой процедуры заключается в улучшении обнаружения микрометастазов в легких мышей ex vivo при сохранении раздутой архитектуры легких. Это достигается путем первичной перфузии легкого in situ u с помощью PBS для удаления крови, которая является основным источником цветового фона в этой ткани. Следующие шаги заключаются в том, чтобы надуть легкое путем инъекции PFA, а затем отщипнуть, чтобы зафиксировать легочную ткань под надуванием.

Далее легкое удаляется и далее фиксируется в PFA или отдельные доли легкого заводятся для криосекции. Заключительными этапами являются окрашивание тканей в растворе Xal и визуализация опухолевых клеток LA Zag, в конечном итоге метастазирование на целых долях легких или в срезах легочной ткани может быть обнаружено вплоть до уровня одной клетки с помощью бинокулярного микроскопа или светового микроскопа. Основное преимущество этой методики перед существующими методами, подобно тому, как небо стоит само по себе, заключается в том, что обнаруживаемость микрометастазов значительно улучшается за счет удаления фона, связанного с кровью.

Начните протокол с обезболивания мыши с помощью внутрибрюшинной инъекции кетамина, ксилазина и промазина в дозе примерно 150 микролитров PBS. Когда болевые рефлексы мыши перестают наблюдаться, фиксируют ее на операционном столе. Откиньтесь вниз и причешите волосы 70% этанолом.

Откройте кожу от живота до шеи. Оттяните кожу в стороны или снимите ее. Осторожно вскройте брюшину в грудной клетке, чтобы предотвратить разрыв крупных сосудов, таких как яремные велись.

Это повысит эффективность перфузии. Теперь разрежьте кардис из полой вены под печенью с помощью 20-миллилитрового шприца с иглой от 21 до 24 калибра. Медленно вводите от 10 до 15 миллилитров PBS в правый желудочек бьющегося сердца до тех пор, пока легкое не станет полностью белым и сердце не перестанет биться.

Затем отщипывают сосудистым зажимом кровеносные сосуды над печенью и диафрагмой. Загрузите 10-миллилитровый шприц с 3%-ным параформным альдегидом и с помощью иглы 21-24 калибра введите в правый желудочек. Примерно два миллилитра.

Обнажите трахею за пределами грудной клетки и надуйте легкое с помощью инъекции в трахею около трех миллилитров альдегида извне грудной клетки. Затем сразу после извлечения иглы отщипнуть трахею, избалованную до места прокола сосудистым зажимом и подождать 10 минут, чтобы дать возможность фиксации. Далее пересеките кровеносные сосуды над сосудистым зажимом.

Затем снимите зажим и введите примерно два миллилитра PBS в правый желудочек, чтобы удалить избыток формальдегида. Проколите иглой нижние части всех долей легкого и снимите сосудистый зажим у трахеи. Теперь введите от трех до пяти миллилитров разведенного раствора для заделки в трахею, избалованную до другой инъекции.

Прекратите инъекцию, когда параформа, скрытая в долях легких, будет заменена раствором. Осторожно удалите легкое, подтягивая сердце щипцами и пересекая соединительнотканные связки, кровеносные сосуды и трахею. Обязательно следите за тем, чтобы сердце было связано с легкими.

Отложите одну долю для криосеков и используйте оставшуюся легочную ткань для полного длительного окрашивания. Поместите легкое в пластиковый стаканчик с плотно закрывающейся крышкой и зафиксируйте его 2%-ным формальдегидом и PBS. Положите кусок марли поверх легкого, чтобы удержать его в растворе, и дайте ему постоять при комнатной температуре в течение 30 минут.

Через полчаса удалите фиксирующий раствор и тщательно промойте ткань PB S3 раза, приготовьте свежий готовый к использованию раствор xal, разведя один миллилитр стокового раствора Xal, один к 40 в основном растворе для окрашивания и добавьте не менее 10 миллилитров его в чашку. Утопите легкое с помощью куска марли. Плотно закройте крышку, чтобы обеспечить воздухообмен, и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение трех-пяти часов в защищенном от света месте.

После инкубации удалите раствор xal. Один раз промойте легкие PBS, чтобы удалить остатки раствора xal, и добавьте не менее 10 миллилитров 4%-ного параформного альдегида в PBS. Теперь ткань готова к гистологии и может долго храниться в 4% PFA при четырех градусах Цельсия.

Начните с заполнения одной трети закладочной формы неразбавленной закладочной средой из полифорзе. Затем загрузите долю легкого в форму и продолжайте добавлять среду, пока доля не будет полностью покрыта. Тщательно избегайте образования пузырьков воздуха, теперь инкубируйте встроенную долю при температуре четыре градуса Цельсия в течение 20 минут.

Далее подготовьте заложенные легкие к рассеканию, медленно замораживая их в смеси сухого льда и изопа пентана. При необходимости они теперь могут быть перемещены в морозильную камеру с температурой минус 80 градусов Цельсия для хранения на криостате, разрезанном на семь-10 микрон криосекции лопасти Установите секции на коммерчески доступные готовые слайды для криосекций После установки немедленно инкубируйте секции в растворе для окрашивания xal при температуре 37 градусов Цельсия в течение 24 часов в увлажненной камере. На следующий день промойте слайды в PBS дважды по пять минут за одно полоскание.

После этого кратко промойте в дистиллированной воде. Теперь запачкайте предметные стекла ядерным быстрым красным в течение 10 секунд, чтобы получить слабое противостойное пятно, которое делает xal более доминирующим, и немедленно промойте противостойное пятно дистиллированной водой. Чтобы получить более темное пятно, увеличьте время до 30 секунд или более.

Закрепите предметные стекла с помощью иммунокрепления. Повторно исследовано формирование метастазов на восьми моделях ОС мышей. Использование описанных здесь репрезентативных изображений перфузированных и неперфузированных легких мышей, которым одновременно вводили слабые трансдуцированные и нонт-трансдуцированные контролируемые ДО, и LM восьми клеток мышей, которым вводили контролируемые ДН.

Макроскопические и микроскопические метастазы оставались неопределяемыми в неперфузированных и перфузированных легких. Но интересно, что у мышей, которым вводили dun LA Z-клетки, окрашивание xgl выявило синие микрометастатические очаги одиночных клеток или кластеров мелких клеток на поверхности неперфузированных легких. Перфузия in situ и фиксация легких еще больше улучшают обнаруживаемость dun la z микрометастазов, однако у мышей, которым вводили контрольные LM восемь клеток, не наблюдалось. В неперфузированных легких были распознаны едва обнаруживаемые макрометастатические очаги размером более 0,1 мм в диаметре. Перфузия легкого не улучшила выявление очагов.

Тем не менее, у мышей, которым вводили LAC Z-клетки, на поверхности неперфузированных органов были обнаружены множественные макростазы X-gal с окрашиванием в синий цвет. Микрометастазы были обнаружены и на поверхности неперфузированных органов. Кроме того, перфузия легких еще больше улучшила обнаруживаемость макро- и микрометастазов.

Следовательно, микро- и макрометастазы стали заметны с более высокой плотностью и большим количеством, в основном из-за полупрозрачности перфузированной ткани, в которой также стали видны очаги под поверхностью органа. Дополнительный гистологический анализ с использованием крио-срезов легочной ткани подтвердил улучшенную обнаруживаемость метастазов в легких у мышей, которым вводили LAX Z transduced done, и LM 8 у мышей с первичными опухолями, полученными из клеток Dun LAX Z. В срезах легких были распознаны микрометастазы или даже одноклеточные очаги.

У мышей с первичными опухолями соответствующих контрольных клеток этого не наблюдалось. Кроме того, макрометастазы также были более четко заметны у мышей, которым вводили LM восемь клеток LA C, чем у животных с контрольными LM 8 клетками. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как проводить перфузию и фиксацию легких в ЗИ 2 и последующее окрашивание метастазов в иссеченных легких.

Этот метод является высокочувствительной конечной точкой для считывания распределения метастазов в легких при любом исследовании рака, а также может служить ориентиром для улучшения современных методов визуализации in vivo, таких как микрокт, ПЭТ и МРТ, используемых для раннего выявления метастатических поражений.