4.12: Коиммунопреципитация и анализы на понижение

Ко-иммунопреципитация (CoIP) и анализы pull-down являются тесно связанными методами выявления стабильных белок-белковых взаимодействий. Эти методы связаны с иммунопреципитацией — методом отделения целевого белка, связанного с антителом, от несвязанных белков. При CoIP связанный с антителом белок сам связывается с другим белком, который не связывается с антителом, после чего следует процесс разделения, который сохраняет белок-белковый комплекс. Разница в анализах заключается в том, что белки-приманки с аффинитетной меткой заменяют антитела, а аффинная хроматография используется для выделения белково-белковых комплексов.

В этом видео рассказывается о CoIP, понижающих анализах и их применении в лаборатории. В нем описан пошаговый протокол для каждого метода, включая реагенты, аппараты и инструменты, используемые для очистки и анализа связанных белков. Кроме того, в разделе «Приложения» этого видео описывается процедура изучения того, как белки миксовируса ингибируют нуклеопротеины гриппа, исследование роли ионов кальция в кальмодулине с помощью анализа pull-down и модифицированный анализ pull-down для характеристики переходных белковых взаимодействий.

Белок-белковые взаимодействия играют значительную роль в широком спектре биологических функций. Большинство белок-белковых взаимодействий и их биологические эффекты еще предстоит определить. Ко-иммунопреципитация, или CoIP, и pull-down анализы являются двумя тесно связанными методами идентификации стабильных белок-белковых взаимодействий. В этом видео будут рассмотрены принципы работы двух анализов, их общие лабораторные процедуры и применение этих методов.

CoIP и pull-down анализы являются вариантами иммунопреципитации, метода селективного выделения одного вида белка из сложного раствора. В эксперименте по иммунопреципитации антитело, специфичное к белку-мишени, может сформировать иммунный комплекс с этой мишенью в образце. Затем комплекс захватывают на твердой основе, обычно белке А, связанном с бусиной сефарозы. Любые незахваченные белки удаляются на этапах центрифугирования. Затем белок высвобождается из антитела и твердой основы путем кипячения в буфере для загрузки образцов SDS-PAGE.

Ко-иммунопреципитацию проводят таким же образом, за исключением того, что интактные белковые комплексы захватываются на твердой основе. Антитело связывается с белком-мишенью, который, в свою очередь, связывается с другим белком, на который антитело не нацелено. Как и при иммунопреципитации, белковый комплекс высвобождается из антител и твердой подложки путем кипячения в буфере для загрузки проб SDS-PAGE.

Pull-down анализы похожи на ко-иммунопреципитацию, отличаясь только использованием белка-приманки, в отличие от антитела. С помощью методов молекулярной биологии этот белок приманки создается с помощью аффинной метки, такой как ряд остатков гистидина. Эти аффинные метки описаны в статье «Разделение биомолекул на основе хроматографии». Затем белок захватывают на иммобилизованном аффинном лиганде, специфичном для метки. Затем захваченный белок инкубируется с образцом, который содержит белки, образующие комплексы с «приманкой». Белковый комплекс высвобождается из аффинной поддержки путем промывки раствором, содержащим конкурентный аналит, специфичный для метки на белке-приманке. Анализы pull-down полезны для подтверждения белковых взаимодействий, предсказанных с помощью ко-иммунопреципитации, и для обнаружения неизвестных белковых взаимодействий.

Теперь, когда мы обсудили принципы коиммунопреципитации и pull-down анализов, давайте рассмотрим их лабораторные процедуры.

Для начала давайте обсудим ко-иммунопреципитацию. К серии микрофуговых пробирок добавляют: буфер PBS и 50% раствор белка А-сефарозы, смоляно-белкового комплекса, который связывается с антителом. Пробирки с микрофугами вращаются для обеспечения правильного распределения, а затем смола промывается дополнительным буфером PBS. В микропробирки добавляют лизат клеток, содержащий нужный белок, и 2 г антитела, и смесь вращают в течение 1 ч при 4 °C. Шарики гранулируются центрифугированием, надосадочная жидкость отбрасывается, а бусины повторно трижды промываются буфером для удаления несвязанного белка. Гранулы, содержащие комплекс антитело-белок, находятся в буфере для восстановления SDS-PAGE для загрузки образца, для удаления комплекса из антитела и для анализа с помощью SDS-PAGE и иммуноблоттинга.

Теперь мы обсудим процедуру понижающих анализов: белок-приманка экспрессируется в плазмиде с соответствующей аффинной меткой. После достижения роста логарифмической фазы клетки лизируют, а затем центрифугируют. Взвешенные стрептавидин-сефарозные шарики, которые захватывают помеченный биотином «приманочный» белок, пипетируются в микрофуговую пробирку. Затем шарики центрифугируют, а надосадочную жидкость осторожно удаляют с помощью аспирации. Затем шарики промывают буфером, центрифугируют и удаляют надосадочную жидкость.

Клетки, содержащие предполагаемый белок «добычи», который имеет сродство к белку «приманки», собирают центрифугированием. Затем надосадочную жидкость добавляют в микропробирку, содержащую смолу, и инкубируют при 4 ? С в течение 3 ч на шейкере. Затем смолу центрифугируют, надосадочную жидкость удаляют, а смолу промывают для удаления несвязанного белка. В смолу добавляют буфер для элюирования, и смесь инкубируют при комнатной температуре в течение 30 минут на шейкере. Затем смолу центрифугируют, а надосадочную жидкость, содержащую нужный комплекс, анализируют с помощью иммуноблоттинга.

Теперь, когда мы рассмотрели процедуры, давайте рассмотрим некоторые полезные применения ко-иммунопреципитации и анализов pull-down.

Ко-иммунопреципитация может быть полезна для лучшего понимания механизма действия ферментов. Устойчивые к миксовирусам или Mx-белки ингибируют широкий спектр вирусов, включая грипп А, механизм которого плохо изучен. Для изучения взаимодействия между белком Mx1 мыши и нуклеопротеином гриппа использовали ко-иммунопреципитацию.

Анализы на понижение оказались полезными для изучения эффектов вторых мессенджеров, которые представляют собой белки, передающие сигнал из клеточной среды. Они являются компонентом сигнального пути, в котором несколько белков взаимодействуют в ответ на сигналы окружающей среды. Ионы кальция действуют как вторичные посланники, связываясь с кальмодулином, который, в свою очередь, связывается с широким спектром белков, опосредуя многие типы биологических реакций. Без кальция белок не может связываться с кальмодулином. Был проведен анализ с понижением давления для проверки способности белков связываться с кальмодулином в присутствии или отсутствии ионов кальция.

Ко-иммунопреципитация и анализы pull-down обычно используются для анализа стабильных или сильных белковых взаимодействий, но не транзиторных. Недавняя разработка в области pull-down анализов, HaloTag, упростила изучение переходных белковых взаимодействий; HaloTag представляет собой генетически кодируемую метку для слияния белков, слитую с интересующим белком, способную химически реагировать с твердым носителем галоалканом. Если требуется функциональный анализ, белковый комплекс, за вычетом метки, может быть выделен целиком путем инкубации с протеазой вируса травления табака.

Вы только что посмотрели видео JoVE о ко-иммунопреципитации и анализах pull-down. В этом видео описаны принципы работы этих двух методов, общие лабораторные процедуры и некоторые из их применений.

Спасибо за просмотр!