Подготовка Ломтики свежих сетчатки от взрослых рыбок данио для Ex Vivo изображений эксперименты

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы подготовить свежие срезы сетчатки данио-рерио для экспериментов, требующих живой визуализации флуоресцентных белков или биосенсоров. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области исследования зрения, такие как физиологическая и метаболическая роль ионов кальция в определенных типах клеток и клеточных компартментах сетчатки. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он предоставляет пространственную и временную информацию о ключевых метаболитах и сигнальных молекулах в живых тканях.

Чтобы сделать возможным удаление пигментного эпителия сетчатки, или РПЭ, у рыбок данио-рерио, отреагируйте на них в течение одного часа перед тем, как сделать срезы тканей. Для камеры нарезки нарисуйте линии лака для ногтей на предметном стекле. С помощью прозрачного лака для ногтей нарисуйте узкие линии, чтобы получился прямоугольник.

Перекрасьте полироль один раз, когда высохнет. Если камера будет использоваться для статической визуализации или инъекционных экспериментов с минимальным потоком раствора, то с помощью шприца нанесите две параллельные полоски вазелина на покровное стекло, длиной в один сантиметр и на расстоянии 0,5 сантиметра друг от друга. Теперь подготовьте лезвия.

Сначала очистите обоюдоострую бритву этанолом и дайте ей высохнуть на воздухе. Затем с помощью ножниц разрежьте его примерно на один сантиметр кусочка. Затем поместите камеру для нарезки на столик для слайсера для бумаги, расположите ее горизонтально на столешнице и отметьте длинный край перманентным маркером для выравнивания.

Затем загрузите кусок лезвия на рычаг слайсера. Закрепите лезвие так, чтобы край находился над серединой слайда и проходил параллельно поверхности слайда, но не касался лака для ногтей. Затем опустите рычаг лезвия на четверть оборота.

Теперь попробуйте нарезать фильтровальную бумагу. При необходимости установите лезвие на место. Чтобы продолжить, с помощью шприца нанесите одну, маленькую точку желе в 10-сантиметровую посуду, примерно в 1,5 сантиметрах от середины.

Затем вдавите сухую сторону покровного стекла в желе с помощью щипцов. Далее поставьте еще одну маленькую точку желе примерно в одном сантиметре от входного края камеры визуализации. Теперь с помощью иглы 20 калибра сделайте две тонкие параллельные полоски вазелина длиной один сантиметр вдоль центра камеры для нарезки на расстоянии примерно одного сантиметра друг от друга.

Затем переложите рыбку данио в блюдо и вывихните рыбу шейным способом, не обезглавливая. Теперь с помощью проволочной петли ослабьте соединительную ткань вокруг одного глаза, а затем осторожно потяните глаз вперед. Далее аккуратно разрежьте белый зрительный нерв под глазом с помощью микроножниц, но не режьте заднюю часть глаза.

Чтобы продолжить, перенесите глаз в тарелку с холодным раствором Рингера на лед. Затем соберите второй глаз. Продолжайте работать на красный свет, пока не будет удален весь СИЗОД.

Далее перенесите один глаз в каплю холодного раствора Рингера на предметное стекло на чашке Петри. Затем поместите чашку под маломощный микроскоп для препарирования, чтобы препарировать наглазник под красным светом. Сначала прокалывайте роговицу тонкими щипцами.

Затем с помощью щипцов и ножниц аккуратно удалите кусочки прозрачной ломкой роговицы и серебристой склеры. Затем снимите и выбросьте хрусталик, а большую часть склер изолировать наглазник. С минимальными усилиями удалите любые кусочки жира и склеры, которые остаются прикрепленными к наглазнику, не удаляя сетчатку.

Если сетчатка отделяется от СИЗОД, действуйте с особой осторожностью, чтобы не повредить нежную сетчатку. Теперь переместите наглазник открытой стороной вниз и разрежьте его на три или четвертинки новым лезвием. Выбросьте части наглазника, которые слишком изогнуты, чтобы их можно было расплющить.

Эти детали часто слишком малы, чтобы быть полезными в любом случае. Чтобы закрепить участки сетчатки, смочите лист фильтровальной бумаги раствором Рингера и с помощью плоских щипцов поместите его рядом с частями наглазника. Затем погрузите фильтровальную бумагу и салфетки в холодный раствор Рингера.

Затем с помощью щипцов расположите кусочки сетчатки поверх фильтровальной бумаги так, чтобы RPE и фоторецепторы были вверху. Аккуратно обработайте края наглазников тонкими щипцами, чтобы сориентировать их в одну линию в центре фильтровальной бумаги. Теперь расплющите сетчатку, с помощью щипцов поднимите фильтровальную бумагу с прикрепленной сетчаткой и положите ее на сухое бумажное полотенце.

В течение примерно трех секунд дайте силе впитывания жидкости в бумажное полотенце расплющить сетчатку. Обработайте таким образом все кусочки сетчатки, только не дайте им высохнуть. Теперь нанесите каплю раствора Рингера и с помощью тонких щипцов снимите оставшиеся черные листы РПЭ с ткани.

Аккуратно отклеите, и если сетчатка оторвется от бумаги, удалите больше раствора, как и раньше, и она снова должна сплющиться. Теперь переложите бумагу с кусочками сетчатки на предметное стекло и обрежьте бумагу в прямоугольник, оставив примерно по 0,5 сантиметра по обе стороны от ряда ткани. Затем переместите фильтровальную бумагу в подготовленную камеру для нарезки.

Вставьте длинные края фильтровальной бумаги в тонкие линии вазелина с помощью щипцов, а затем погрузите сетчатку в три-четыре капли холодного раствора Рингера. Сначала переведите препарат на стадию слайсера для тканей. Расположите длинную кромку вдоль отмеченной линии и закрепите концы камеры на столе лабораторным скотчем.

Затем, начиная с одного конца, разрежьте сетчатку глаза и фильтровальную бумагу, сильно и осторожно надавливая на режущую руку. Убедитесь, что первый ломтик был разрезан полностью, а затем приступайте к нарезке с помощью микрометра ломтиков толщиной примерно 400 микрон. Далее перенесите камеру с нарезанными срезами в чашку Петри, содержащую подготовленный покровный лист, который будет служить лестницей для визуализации.

Залейте чашку холодным раствором Рингера и поставьте ее на столик для препарирующего микроскопа. Теперь, при малом увеличении, используйте щипцы, чтобы закрепить полоску, и переместите ее на лестницу визуализации, сдвинув лежащую под ней чашку Петри. Поверните ломтики на 90 градусов и закопайте края фильтровальной бумаги в желе.

Важно держать сетчатку погруженной в воду и избегать прямого контакта с сетчаткой. Затем переместите срезы на лесенках так, чтобы слои сетчатки были хорошо видны. Для срезов на каждом конце лестницы сделайте сетчатку обращенной внутрь к другим срезам, чтобы свести к минимуму движение во время инъекции или потока.

Выбросьте все срезы, которые плохо прилипают к бумаге. Теперь окрасьте ткань. Тем временем подготовьте камеру визуализации и инъекционный аппарат

Сначала промойте трубку раствором Рингера, пока не останется пузырьков воздуха. Затем подсоедините трубку к входу камеры визуализации и закройте запорный кран. Затем снова наполните шприц раствором для инъекций и снова прикрепите его к трубке.

Теперь с помощью щипцов перенесите подготовленную лестницу для визуализации в камеру для визуализации. Вдавите его в точку желе у входного края и заполните камеру раствором Рингера, чтобы покрыть ломтики. Затем приступайте к визуализации.

С помощью описанных методик можно визуализировать идеально пересеченные срезы через все слои сетчатки. При незначительном вращении будут видны пучки внешних сегментов. С помощью ПИ окрашивания можно исключить из анализа мертвые клетки.

Здоровые PI-негативные фоторецепторы имеют стереотипную поляризованную удлиненную морфологию. В кислородонасыщенных аппаратах Рингера их можно визуализировать в течение четырех часов. Одной из стратегий визуализации является визуализация динамики эндоплазматического ретикулума фоторецептора колбочек относительно ядра.

Использование тканей, экспрессирующих GFP, и конуса ER, при этом противодействие ядерному красителю. Аналогичная стратегия может быть использована для просмотра цитоскелета актина с тканью, экспрессирующей GFP-слитый актин. Используя покадровую визуализацию, можно наблюдать клеточную динамику, такую как цитозольные колебания кальция в колбочке фоторецептора.

Например, при изотоническом истощении натрия в камере визуализации, GCaMP можно использовать для визуализации повышения концентрации цитозольного кальция. Количественно оценивая флуоресцентные реакции внешних сегментов отдельных колбочек, тел клеток и синапсов, можно определить внутриклеточную динамику кальция во время фармакологических манипуляций и т.д. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о красном свете, прежде чем СИЗОД будет удален.

Тщательно расправьте наглазники перед тем, как нарезать, и всегда держите ломтики погруженными. После освоения диссекция тканей, срез и подготовка к визуализации могут быть выполнены менее чем за 30 минут. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как готовить срезы сетчатки у рыбок данио, изучить обмен веществ и физиологию в конкретных типах клеток в клеточных компартментах.