Полуколичественного обнаружение РНК зависимой РНК-полимеразы активности человека теломеразы транскриптазы белка

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биологии РНК, например, каково биологическое значение RdRP или TERT в клетках человека? Основное преимущество этой методики заключается в том, что этот анализ признан первым чувствительным методом обнаружения активности RdRP человека, экспрессируемой в клетках. Начните эту процедуру с препарирования клеток HeLa, как описано в текстовом протоколе.

Промойте клетки один раз 10 миллилитрами PBS. Затем центрифугируйте образец при давлении в 1,450 раза сильнее силы тяжести в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия и выбросьте надосадочную жидкость. Используйте один миллилитр ледяного буфера для лизиса A на 10 миллионов клеток, чтобы лизировать клетки с помощью щадящего пипетирования.

Ультразвуковую обработку образца в пробирке объемом 1,5 миллилитра при усилении ультразвуком 25% в течение 10 секунд. После ультразвуковой обработки центрифугируйте образец при температуре 20, 400 раз сильнее силы тяжести в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия. Соберите надосадочную жидкость и перелейте по одному миллилитру надосадочной жидкости в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 миллилитров.

Предварительно очистите лизат, добавив 40 микролитров предварительно промытых шариков белка А-агарозы на один миллилитр лизата. Хорошо перемешайте, несколько раз перевернув трубку. Затем поворачивайте образец в течение 30 минут при температуре четыре градуса Цельсия.

Центрифугируйте образец при 13 000-кратном теперешнем весе в течение одной минуты при четырех градусах Цельсия и восстановите надосадочную жидкость. Затем добавьте 40 микролитров предварительно промытых шариков белка А-агарозы и 10 микрограммов антител против человеческого TERT в предварительно очищенный лизат. Хорошо перемешайте, перевернув пробирку несколько раз, и поверните образец на четыре градуса Цельсия на ночь.

После центрифугирования при 3, 300-кратном течении силы тяжести в течение 30 секунд при четырех градусах Цельсия удалите надосадочную жидкость. Далее промойте бусины с помощью Wash Buffer One. Добавьте один миллилитр Wash Buffer One в бусины и хорошо перемешайте, перевернув тюбик.

Затем вращайте образец в течение пяти минут при температуре четыре градуса Цельсия. Центрифугируйте образец при 3,300-кратном течении силы тяжести в течение 30 секунд при четырех градусах Цельсия. Удалите надосадочную жидкость и повторите этот шаг еще три раза.

После промывки раствором AGC, как описано в текстовом протоколе, обработайте гранулы микрококковой нуклеазой, повторно суспендируя их в 60 микролитрах реакционной смеси микрококковой нуклеазы с помощью осторожного пипетирования. Затем аккуратно встряхните образец на поворотном столе шейкера, установленного в инкубаторе типа Пельтье, в течение 15 минут при температуре 25 градусов Цельсия. После центрифугирования образца при 3,300-кратном течении силы тяжести в течение 30 секунд при четырех градусах Цельсия удалите надосадочную жидкость.

Наконец, дважды промойте бусины раствором AGC, содержащим три миллимоляра EGTA, и промойте бусины один раз с помощью Wash Buffer Two, как описано в текстовом протоколе. Приготовьте реакционную смесь RdRP в новой пробирке, как описано в текстовом протоколе. Добавьте в реакционную смесь шесть микролитров уридинтрифосфата, меченного по альфа-фосфатной группе с помощью P dash 32, и хорошо перемешайте с помощью пипетирования.

Затем добавьте в смесь один микролитр матричной РНК и хорошо перемешайте. Суспендируйте шарики 20 микролитрами полученной реакционной смеси RdRP. Далее аккуратно встряхните образец на поворотном столе шейкера, установленного в инкубаторе типа Пельтье, в течение двух часов при температуре 32 градуса Цельсия.

После инкубации добавьте в реакционную смесь 5,4 микролитра 20 мг на миллилитр протеиназы К и 45,4 микролитра буфера 2X протеиназы К. Перемешайте с помощью пипетирования и встряхните образец в инкубаторе типа Пельтье в течение 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия. После добавления в образец 109,2 мкл воды, не содержащей РНКазы, добавьте 200 мкл кислотного фенол-хлороформа.

Хорошо перемешайте с помощью вихря перед центрифугированием образца при 21, 100-кратной гравитации в течение пяти минут при комнатной температуре. Перенесите водную фазу в новую трубку. Повторите этот шаг один раз.

Затем добавьте в водную фазу 20 микролитров трех моляров ацетата натрия, pH 5,2, четыре микролитра осадочного носителя и 250 микролитров этанола. Хорошо встряхните трубку для смешивания. Центрифугируйте образец при температуре 21, в 100 раз сильнее силы тяжести в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия и выбросьте надосадочную жидкость.

Далее промойте гранулу с 300 микролитрами холодного 70% объема на объем этанола, хранящегося при температуре минус 20 градусов Цельсия. Центрифугируйте образец при температуре 21, в 100 раз сильнее силы тяжести в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия. Выбросьте надосадочную жидкость и высушите гранулы на воздухе.

Повторно суспендируйте гранулу в 20 микролитрах воды, не содержащей РНКазы. Приготовьте реакционную смесь РНКазы в новой пробирке, как описано в текстовом протоколе. Добавьте в образец 180 микролитров реакционной смеси РНКазы.

Затем инкубируйте пробирку в течение двух часов при температуре 37 градусов Цельсия. Добавьте в образец 2,3 микролитра 10% объема на объем SDS и инкубируйте в течение 15 минут при температуре 37 градусов Цельсия. Затем добавьте в образец два микролитра протеиназы К по 20 мг на миллилитр и инкубируйте еще 15 минут при температуре 37 градусов Цельсия.

Теперь добавьте в образец 205 микролитров кислотного фенол-хлороформа. После смешивания и центрифугирования, как и раньше, перенесите водную фазу в новую пробирку. Добавьте три моляра ацетата натрия, носитель осадка и этанол в водную фазу, после чего перемешайте, центрифугируйте и промывка гранул, как это было сделано ранее.

Здесь представлены три репрезентативных результата анализа IP-RdRP в клетках HeLa, обработанных нокодазолом или ДМСО для неманипулированных клеток. В качестве матрицы использовалась химически синтезированная 34-нуклеотидная РНК. После ночного воздействия продукты RdRP могут обнаруживаться от 20 до 30 нуклеотидов, особенно в клетках HeLa в митотической фазе.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как определить активность RdRP человека TERT.