Секвенирование нового поколения и биоинформатики трубопровода для оценки генетических детерминант конституционных болезни
4 апреля 2018 г.
Целевые секвенирование нового поколения является время - и экономически эффективного подхода, который становится все более популярным в болезни исследований и клинической диагностики. Протокол, описанные здесь представляет сложных рабочих процессов, необходимых для секвенирования и биоинформатики процесс, используемый для выявления генетических вариантов, влияющих на болезнь.
Общая цель целевого секвенирования нового поколения заключается в выяснении генетических детерминант различных конституциональных заболеваний, уделяя особое внимание областям генома, представляющим особый интерес. Этот метод может помочь нам ответить на ключевые вопросы, касающиеся генетической идеологии заболевания, особенно когда существуют ранее известные генетические ассоциации. Эта методика отличается высокой эффективностью.
Он производит миллионы операций чтения за короткий промежуток времени, мы получаем их по относительно низкой цене, имеет относительно низкую вычислительную нагрузку, особенно когда мы сравниваем его с другими подходами к секвенированию следующего поколения. Применение этого метода распространяется на диагностику нейродегенеративных заболеваний, которые являются фенотипически и генетически неоднородными, но имеют много известных ассоциированных генетических локусов. Хотя этот метод особенно направлен на нейродегенеративные заболевания, он также может быть применен к различным другим конституциональным заболеваниям с ранее идентифицированными областями генома, представляющими интерес.
Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, будут испытывать трудности, потому что биоинформатическая обработка, необходимая для окончательного анализа редких вариантов, может быть ресурсоемкой и создавать множество источников ошибок. При этой процедуре образцы человеческой крови собираются в три, четыре миллилитровые пробирки ЭДТА К2, чтобы обеспечить общий объем около 12 миллилитров. Центрифугируйте образцы крови при 750-кратной гравитации в течение 20 минут.
Это позволит разделить каждый образец на верхнюю фазу плазмы, тонкую среднюю фазу лейкоцитов и нижнюю фазу эритроцитов. Пипеткой удалите плазму из верхней части образца крови с помощью одноразовой пипетки для переноса. Разложите на несколько аликвот по 500 микролитров и храните при температуре минус 80 градусов Цельсия для будущего биохимического анализа.
Извлеките ДНК из образца крови с помощью набора для забора крови в соответствии с инструкциями производителя. Извлеченная ДНК затем используется для подготовки библиотеки секвенирования для секвенирования следующего поколения. После завершения выполнения секвенирования найдите на компьютере файлы в облачной вычислительной среде, выбрав Runs (Выполнения) на панели навигации.
Выберите соответствующий последовательность выполнения, чтобы перейти на страницу сводки по выполнению. Выберите Загрузить, чтобы получить данные из облака. В появившемся диалоговом окне выберите файлы FASTQ в качестве типа файла для загрузки и нажмите кнопку Загрузить.
На странице «Сводка по выполнению» облачной вычислительной среды перейдите в раздел «Диаграммы», чтобы проанализировать качество выполнения последовательности с различными цифрами, полученными в вычислительной среде. На странице Run Charts найдите рисунок с надписью Data By Cycle, в разделе Chart выберите Intensity, а в разделе Channel выберите All Channels, чтобы построить график интенсивности сигнала. На панели «Навигация по запуску» выберите вкладку «Контроль качества индексирования», чтобы найти гистограмму контроля качества индексирования, которая находится в правой части страницы.
На странице "Сводка по выполнению" облачной вычислительной среды нажмите кнопку "Метрики" на панели навигации "Выполнить", чтобы перейти к метрикам качества. В разделе Плотность кельвинов на миллиметр в квадрате убедитесь, что кластерная плотность секвенирования находится в диапазоне, рекомендованном используемым комплектом для обогащения. В этом случае от 1 200 до 1 400 кельвинов на квадратный миллиметр.
В поле Общий процент больше или равно Q30 убедитесь, что значение больше или равно 85 %, что отражает качество последовательных чтений. В поле Выровнено убедитесь, что значение аналогично проценту положительного контроля, который был включен в прогон секвенирования. Например, если использовался 1%положительный контроль, ожидаемый выровненный процент будет составлять примерно от 1 до 5%, а вариации в пределах нескольких десятичных знаков допустимы.
Начните этот процесс с импорта данных секвенирования FASTQ в программное обеспечение для обработки данных. В области навигации щелкните правой кнопкой мыши и выберите «Новая папка». Присвойте папке имя таким образом, чтобы было понятно, какой последовательность была выполнена.
На панели инструментов вверху выберите «Импорт» и в раскрывающемся списке выберите платформу, с помощью которой была выполнена секвенирование. Для целей ONDRISeq выбирается Ilumina. В диалоговом окне перейдите к файлам FASTQ из обрабатываемого сеанса секвенирования и выберите их.
В диалоговом окне Общие параметры щелкните поле рядом с пунктом Парные чтения, если при секвенировании использовались парные конечные химические составы. В диалоговом окне Информация о сопряженном чтении выберите Сопряженный, если файл FASTQ для прямого чтения отображается перед файлом обратного чтения в списке файлов. Установите минимальное расстояние чтения в паре равным единице, а максимальное расстояние равным 1000.
В параметрах Ilumina диалогового окна выберите Удалить неудачные операции чтения. В раскрывающемся списке Оценка качества выберите конвейер NGS, который использовался для секвенирования. Нажмите кнопку Далее в нижней части диалогового окна.
Выберите Сохранить и создать вложенные папки для каждой единицы пакета. Нажмите кнопку Далее в нижней части диалогового окна. Выберите папку, которая была создана ранее.
Именно сюда будут импортированы файлы FASTQ. Выберите «Готово» в нижней части диалогового окна и дождитесь импорта файлов FASTQ. Перейдите на вкладку Процессы, чтобы просмотреть статус импорта файла.
Затем разработайте рабочий процесс в программном обеспечении для выполнения повторного секвенирования и вызова вариантов в соответствии с инструкциями производителя. Проектирование рабочего процесса изменения последовательности и вызова вариантов является наиболее сложным аспектом этой процедуры. Наша команда изучила лучшие практики и методом проб и ошибок придумала наиболее надежный рабочий процесс, соответствующий нашим потребностям.
Чтобы запустить импортированные файлы чтения секвенирования FASTQ через настраиваемый рабочий процесс биоинформатики, начните с определения рабочего процесса в наборе инструментов программного обеспечения и дважды щелкните по нему. В появившемся диалоговом окне найдите папки с файлами FASTQ, которые были импортированы в области навигации. Выделите все папки, выбрав их в области навигации, а затем щелкните поле рядом с пунктом Пакетная служба.
Используйте стрелку, направленную вправо, чтобы переместить файлы к выбранным элементам. Нажмите кнопку «Далее» в нижней части диалогового окна. В диалоговом окне просмотрите обзор пакетной обработки, чтобы убедиться, что выбраны правильные файлы FASTQ, а затем нажмите кнопку Далее.
Просмотрите шаги рабочего процесса в диалоговом окне, чтобы убедиться, что при разработке рабочего процесса были выбраны правильные файлы и места экспорта. Эти шаги включают в себя сопоставление операций чтения с ссылочной последовательностью, удаление повторяющихся сопоставленных операций чтения, создание статистики для целевых областей, экспорт файлов BAM, экспорт текста, разделенного табуляцией, фильтрацию на основе перекрытия и экспорт файлов VCF. На последнем шаге в диалоговом окне, Обработка результатов, выберите опцию Сохранить в папке ввода.
Нажмите кнопку Finish в нижней части диалогового окна. Последним шагом является выполнение аннотации вариантов в файле VCF каждого образца, как описано в текстовом протоколе. Методологии, продемонстрированные в этом видео, были применены к 528 образцам ДНК участников от лиц, которые были зарегистрированы в ONDRI.
Сэмплы были прогонены на панели ONDRISeq в 22 прогона по 24 сэмпла в каждом. В целом, данные секвенирования были признаны высокого качества со средним охватом выборки 78 раз. В среднем 95,6% прочтений были сопоставлены с референсной последовательностью, а все прогоны ONDRISeq имели более 90% прочтений.
Из сопоставленных прочтений 92,0% и показатель Phred больше или равен Q30. Чтобы продемонстрировать полезность этого целевого рабочего процесса NGS, представлен пример 68-летнего мужчины, страдающего болезнью Паркинсона, у которого наблюдается сниженное содержание N на выходе. Аннотированные вариации курируются для выявления тех из них, которые с наибольшей вероятностью будут иметь клиническую значимость, как обозначены красными прямоугольниками.
При выполнении этой процедуры важно помнить о том, что шаги должны быть соответствующим образом адаптированы к платформе секвенирования, использованному набору для обогащения и потребностям исследования. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области генетики к получению высококачественных данных, специфичных для конкретных регионов, оставаясь при этом менее дорогим, чем его аналоги с полным экзомом и всем геномомом.
Обзор
Таргетное секвенирование следующего поколения представляет собой экономически эффективный метод идентификации генетических вариантов, связанных с заболеваниями, в частности с нейродегенеративными расстройствами. В данном протоколе описан рабочий процесс секвенирования и соответствующие биоинформатические этапы.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Генетика
- Биоинформатика
- Нейробиология
Теоретические основы
- Таргетное секвенирование направлено на изучение конкретных интересующих областей генома.
- Этот метод является эффективным и экономически выгодным по сравнению с другими подходами к секвенированию.
- Он особенно полезен для изучения генетически гетерогенных нейродегенеративных заболеваний.
- Биоинформатическая обработка данных может быть сложной и подверженной ошибкам для начинающих специалистов.
Цель исследования
- Для выявления генетических детерминант конституциональных заболеваний.
- Для совершенствования методов диагностики нейродегенеративных заболеваний.
- Для оптимизации биоинформатического процесса анализа вариантов.
Используемые методы
- Сбор и обработка образцов крови человека.
- Экстракция ДНК и подготовка библиотек для секвенирования.
- Использование облачных вычислений для управления данными.
- Разработка биоинформатического рабочего процесса для ресеквенирования и поиска вариантов.
Основные результаты
- Успешная идентификация генетических вариантов, связанных с заболеваниями.
- Продемонстрированная эффективность секвенирования и обработки данных.
- Установленные показатели контроля качества для циклов секвенирования.
- Разработанный надежный биоинформатический рабочий процесс для анализа.
Выводы
- Таргетное секвенирование следующего поколения является ценным инструментом для исследования заболеваний.
- Проблемы биоинформатики можно решить с помощью правильного проектирования рабочего процесса.
- Данный метод имеет широкие области применения, выходящие за рамки изучения нейродегенеративных заболеваний.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Таргетное секвенирование следующего поколения (NGS) с использованием надежного биоинформатического конвейера позволяет точно исследовать известные генетические детерминанты конституциональных и нейродегенеративных заболеваний. Данный подход обеспечивает достоверную идентификацию вариантов, что способствует раннему обнаружению и трансляционным исследованиям при оптимизации распределения ресурсов. Его эффективность и масштабируемость делают его стратегическим активом для научно-исследовательских организаций, ориентированных на портфельное развитие и поиск практически значимой генетической информации.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Обеспечивает целенаправленный анализ геномных регионов с установленными ассоциациями с заболеваниями, что повышает уверенность в валидации мишеней.
- Поддерживает снижение механистических рисков за счет уточнения генетической основы фенотипически гетерогенных заболеваний.
- Способствует быстрому отбору перспективных мишеней на основе патогенности и распространенности вариантов.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает высококачественные, регионоспецифичные данные секвенирования для последующей разработки анализа.
- Стандартизирует рабочие процессы выявления и аннотации вариантов, повышая воспроизводимость исследований.
- Предоставляет количественные результаты, подходящие для сравнительного анализа и кроссплатформенного сопоставления.
Трансляционные и доклинические исследования
- Сопоставляет генетические данные с биомаркерами, имеющими значение для заболевания, для обеспечения трансляционной непрерывности.
- Обеспечивает продвижение кандидатов с учетом рисков на основе курируемой значимости вариантов.
- Помогает в выборе доклинических моделей путем подтверждения генетических драйверов в когортах пациентов.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный рабочий процесс таргетного NGS и биоинформатики охватывает весь путь от раннего поиска до трансляционных исследований, обеспечивая переход от идентификации вариантов к функциональной валидации.
- Открытия в биологии: Поддерживает проверку гипотез в отношении известных локусов, снижая биологическую неопределенность.
- Скрининг: Обеспечивает готовность анализа за счет использования валидированных данных секвенирования с высоким покрытием.
- Аналитика: Предоставляет количественные метрики вариантов и пороги качества для надежной интерпретации данных.
- Трансляционные исследования: Связывает генетические результаты с клинической аннотацией и стратегиями поиска биомаркеров.
- Корпоративное повторное использование: Предлагает масштабируемый стандартизированный рабочий процесс, адаптируемый к панелям по различным заболеваниям.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает прогностическую достоверность и точность валидации мишеней за счет высококачественного детектирования вариантов.
- Операционная ценность: Оптимизирует процессы секвенирования и анализа, снижая вычислительную нагрузку и риск ошибок.
- Стратегическая ценность: Позволяет принимать обоснованные решения о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и эффективно распределять ресурсы.
- Влияние на портфель: Обеспечивает приоритизацию с учетом рисков и гармонизацию данных между различными программами.
Особенности реализации
- Требуется опыт в подготовке библиотек для NGS и разработке биоинформатических рабочих процессов.
- Необходим доступ к облачной или высокопроизводительной вычислительной инфраструктуре для обработки данных.
- Требуется строгое соблюдение показателей контроля качества и стандартов аннотации вариантов.
- Метод должен быть адаптирован под конкретную платформу секвенирования, набор для обогащения и панель, специфичную для данного заболевания.
- Ограничено известными геномными областями, что сужает поиск новых вариантов за пределами целевых локусов.
