Высокоэффективные гена срыв мышиных и человека гемопоэтических предшественников клеток ТРИФОСФАТЫ/Cas9

Общая цель этого протокола заключается в достижении быстрого и эффективного разрушения генов с помощью CRISPR/Cas9 и первичных гемопоэтических клеток-предшественников с использованием рибонуклеопротеинового подхода. Этот метод может ответить на ключевые вопросы в области нормального и злокачественного кроветворения, например, каковы молекулярные и фенотипические последствия потери гена X. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он чрезвычайно прост, быстр и экономически эффективен. Расчетное время, необходимое для разработки концепции эксперимента до его выполнения, составляет менее одной недели.

Хотя этот метод был оптимизирован для гемопоэтических клеток-предшественников, он может быть применен к другим типам клеток, таким как первичные Т-клетки, линии гемопоэтических клеток мыши и человека и образцы первичных лейкозов. Идея этого метода пришла нам в голову, когда мы поняли, что другие подходы к доставке CRISPR/Cas9, включая плазмиды и вирусы, либо токсичны для наших клеток, либо имеют медленное время обработки. Чтобы спроектировать интересующие вас однонаправляющие РНК, сначала перейдите на веб-сайт CRISPRscan.

Основываясь на интересующей клетке, нажмите кнопку «Мышь» или «Человек», а затем введите интересующий ген в поле поиска UCSC и нажмите «Перейти». Затем увеличьте масштаб экзона, на который вы хотите нацелиться. Проверьте, перечислены ли какие-либо последовательности мишеней РНК с одним направляющим в заголовке CRISPRscan predictions on Genes.

Затем нажмите на целевую однонаправляющую РНК, помеченную зеленым прямоугольником, и скопируйте полную последовательность, отображаемую под последовательностью Oligo. Затем вставьте последовательность в текстовый документ. Затем добавьте нуклеотиды ATAGC к трем простым концам последовательности.

Разместите заказ на полноразмерную последовательность. Теперь, чтобы синтезировать матрицу ДНК для однонаправляющей РНК, растворите, а затем разбавьте прямые и универсальные обратные праймеры. Затем добавьте все реагенты в пробирку для проведения ПЦР внахлест.

После составления ПЦР-реакции поместите пробирку в термоамплификатор и запустите программу. После завершения программы очистите продукт ПЦР с помощью колонок для очистки ДНК. Разведите ДНК в 11,5 микролитрах элюирующего буфера.

Затем используйте буфер элюирования в качестве заготовки на спектрофотометре. Измерьте концентрацию образца ДНК на спектрофотометре. Сначала смешайте элюированную ДНК, дезоксинуклеотидфосфаты, реакционный буфер и смесь ферментов РНК-полимеразы Т7 в полосковых пробирках для ПЦР.

Затем инкубируйте образец при температуре 37 градусов Цельсия в течение четырех часов. Затем нанесите чистящее средство РНКаза, чтобы удалить РНКазу с перчаток. Затем отрегулируйте объем каждого образца РНК до 50 микролитров с помощью воды, не содержащей нуклеаз.

Очистите РНК в соответствии с инструкциями производителя. Наконец, разбавьте РНК в 50 микролитрах воды, не содержащей нуклеаз. Сначала используйте воду, не содержащую нуклеаз, чтобы заглушить спектрофотометр, а затем измерьте концентрацию элюированной РНК.

Используйте исключение трипанового синего цвета для подсчета количества ячеек. Для каждой репликации соберите 200 000 жизнеспособных клеток на одну репликацию, затем добавьте фосфатно-солевой буфер для промывания клеток. Затем вращайте трубку при 300 умноженных на g в течение семи минут.

После центрифугирования осторожно удалите надосадочную жидкость. Во время центрифугирования инкубируйте 1,5 мкг Cas9 с одним мкг общей однонаправляющей РНК в ПЦР-пробирке в течение 20-30 минут. Это необходимо для подготовки комплексов Cas9-sgRNA RNP для каждой репликации.

После расчета необходимого объема ресуспензионного буфера Т растворить полученную клеточную гранулу в ресуспензионном буфере Т. Затем добавить 10 мкл растворенной клеточной суспензии в ПЦР-пробирку с комплексами Cas9-sgRNA RNP. Далее включите блок электропорации. Вставьте кювету в держатель кюветы.

Затем добавьте три миллилитра буфера Е. Установите условия на устройстве электропорации. Чтобы выполнить электропорацию, сначала держите электропорационный пипетку, затем вытяните коготь и возьмитесь за диск внутри наконечника пипетки, затем сильно нажмите на пипетку, чтобы зафиксировать наконечник. Затем перемешайте образец, пипетируя его вверх и вниз 10 раз.

Наберите 10 микролитров образца и убедитесь, что в нем нет пузырьков воздуха. Далее вставьте наконечник непосредственно в электролитический буфер в кювете для электропорации. Затем нажмите «Пуск» на экране.

Пусть на экране появится полное сообщение. Затем извлеките пипетку из кюветы. Затем выдавите содержимое кюветы в лунку, заполненную новой питательной средой HSPC.

Для изучения эффективности электропорации РНП Cas9-sgRNA выделенные у мышей ГСК электропорируют с помощью однонаправляющей РНКазы, нацеленной либо на GFP, либо на tdTomato. Эти HSPC повсеместно экспрессировали GFP или tdTomato. Проточный цитометрический анализ показывает примерно 75 и 74% потерю экспрессии GFP или tdTomato в HSPC на уровне белка.

Затем проводят анализ на основе Т7-эндонуклеазы с ПЦР-амплифицированной ДНК из локуса GFP электропорированных клеток. Это необходимо для количественной оценки эффективности разрушения генов GFP. Программное обеспечение ImageJ используется для расчета отношения интенсивностей расщепленных и неразделенных полос для расчета процента спайности.

Эффективность трех различных однонаправляющих РНК, нацеленных на CD45 человека, была проверена в клеточной линии ОМЛ HL-60. Проточная цитометрия показала, что однонаправляющая РНК1 является наиболее эффективной с эффективностью нокаута 98% по сравнению с контролем. Затем нокаут CD45 также выполняется в первичных CD34-положительных HSPC пуповинной крови человека с использованием однонаправляющей РНК1.

Анализ проточной цитометрии показывает почти 80% клеток с потерей CD45 без изменения экспрессии CD34 по сравнению только с Cas9. Для изучения приживления человеческих ГСК с нокаутом CD45 у CD34-положительных ретроорбитально трансфицированных мышей НСГ у CD34-положительных ретроорбитально трансфицированных мышей для анализа, показывающих отредактированные клетки как HLA-ABC-положительные и CD45-отрицательные. После освоения этот протокол может быть завершен за три дня, если его выполнение будет скорректировано.

При попытке выполнить эту процедуру важно помнить о том, что все поверхности и реагенты должны быть свободны от РНКазы, проверять эффективное разрушение генов с помощью нескольких методов и использовать надлежащие экспериментальные методы контроля. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как разрабатывать, синтезировать и трансфицировать рибонуклеопротеины Cas9-sgRNA в гемопоэтические клетки-предшественники для получения быстрого и эффективного разрушения генов.