Высокоэффективные гена срыв мышиных и человека гемопоэтических предшественников клеток ТРИФОСФАТЫ/Cas9
10 апреля 2018 г.
Протокол для быстро ТРИФОСФАТЫ/Cas9-опосредованной гена срывов в мышь и гемопоэтических клеток человека основных описанных в этой статье. Cas9-sgRNA ribonucleoproteins вводятся через электропорации с sgRNAs, порожденных через в vitro транскрипция и коммерческих Cas9. Высокая эффективность редактирования достигаются с ограниченного времени и финансовых затрат.
Общая цель этого протокола заключается в достижении быстрого и эффективного разрушения генов с помощью CRISPR/Cas9 и первичных гемопоэтических клеток-предшественников с использованием рибонуклеопротеинового подхода. Этот метод может ответить на ключевые вопросы в области нормального и злокачественного кроветворения, например, каковы молекулярные и фенотипические последствия потери гена X. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он чрезвычайно прост, быстр и экономически эффективен. Расчетное время, необходимое для разработки концепции эксперимента до его выполнения, составляет менее одной недели.
Хотя этот метод был оптимизирован для гемопоэтических клеток-предшественников, он может быть применен к другим типам клеток, таким как первичные Т-клетки, линии гемопоэтических клеток мыши и человека и образцы первичных лейкозов. Идея этого метода пришла нам в голову, когда мы поняли, что другие подходы к доставке CRISPR/Cas9, включая плазмиды и вирусы, либо токсичны для наших клеток, либо имеют медленное время обработки. Чтобы спроектировать интересующие вас однонаправляющие РНК, сначала перейдите на веб-сайт CRISPRscan.
Основываясь на интересующей клетке, нажмите кнопку «Мышь» или «Человек», а затем введите интересующий ген в поле поиска UCSC и нажмите «Перейти». Затем увеличьте масштаб экзона, на который вы хотите нацелиться. Проверьте, перечислены ли какие-либо последовательности мишеней РНК с одним направляющим в заголовке CRISPRscan predictions on Genes.
Затем нажмите на целевую однонаправляющую РНК, помеченную зеленым прямоугольником, и скопируйте полную последовательность, отображаемую под последовательностью Oligo. Затем вставьте последовательность в текстовый документ. Затем добавьте нуклеотиды ATAGC к трем простым концам последовательности.
Разместите заказ на полноразмерную последовательность. Теперь, чтобы синтезировать матрицу ДНК для однонаправляющей РНК, растворите, а затем разбавьте прямые и универсальные обратные праймеры. Затем добавьте все реагенты в пробирку для проведения ПЦР внахлест.
После составления ПЦР-реакции поместите пробирку в термоамплификатор и запустите программу. После завершения программы очистите продукт ПЦР с помощью колонок для очистки ДНК. Разведите ДНК в 11,5 микролитрах элюирующего буфера.
Затем используйте буфер элюирования в качестве заготовки на спектрофотометре. Измерьте концентрацию образца ДНК на спектрофотометре. Сначала смешайте элюированную ДНК, дезоксинуклеотидфосфаты, реакционный буфер и смесь ферментов РНК-полимеразы Т7 в полосковых пробирках для ПЦР.
Затем инкубируйте образец при температуре 37 градусов Цельсия в течение четырех часов. Затем нанесите чистящее средство РНКаза, чтобы удалить РНКазу с перчаток. Затем отрегулируйте объем каждого образца РНК до 50 микролитров с помощью воды, не содержащей нуклеаз.
Очистите РНК в соответствии с инструкциями производителя. Наконец, разбавьте РНК в 50 микролитрах воды, не содержащей нуклеаз. Сначала используйте воду, не содержащую нуклеаз, чтобы заглушить спектрофотометр, а затем измерьте концентрацию элюированной РНК.
Используйте исключение трипанового синего цвета для подсчета количества ячеек. Для каждой репликации соберите 200 000 жизнеспособных клеток на одну репликацию, затем добавьте фосфатно-солевой буфер для промывания клеток. Затем вращайте трубку при 300 умноженных на g в течение семи минут.
После центрифугирования осторожно удалите надосадочную жидкость. Во время центрифугирования инкубируйте 1,5 мкг Cas9 с одним мкг общей однонаправляющей РНК в ПЦР-пробирке в течение 20-30 минут. Это необходимо для подготовки комплексов Cas9-sgRNA RNP для каждой репликации.
После расчета необходимого объема ресуспензионного буфера Т растворить полученную клеточную гранулу в ресуспензионном буфере Т. Затем добавить 10 мкл растворенной клеточной суспензии в ПЦР-пробирку с комплексами Cas9-sgRNA RNP. Далее включите блок электропорации. Вставьте кювету в держатель кюветы.
Затем добавьте три миллилитра буфера Е. Установите условия на устройстве электропорации. Чтобы выполнить электропорацию, сначала держите электропорационный пипетку, затем вытяните коготь и возьмитесь за диск внутри наконечника пипетки, затем сильно нажмите на пипетку, чтобы зафиксировать наконечник. Затем перемешайте образец, пипетируя его вверх и вниз 10 раз.
Наберите 10 микролитров образца и убедитесь, что в нем нет пузырьков воздуха. Далее вставьте наконечник непосредственно в электролитический буфер в кювете для электропорации. Затем нажмите «Пуск» на экране.
Пусть на экране появится полное сообщение. Затем извлеките пипетку из кюветы. Затем выдавите содержимое кюветы в лунку, заполненную новой питательной средой HSPC.
Для изучения эффективности электропорации РНП Cas9-sgRNA выделенные у мышей ГСК электропорируют с помощью однонаправляющей РНКазы, нацеленной либо на GFP, либо на tdTomato. Эти HSPC повсеместно экспрессировали GFP или tdTomato. Проточный цитометрический анализ показывает примерно 75 и 74% потерю экспрессии GFP или tdTomato в HSPC на уровне белка.
Затем проводят анализ на основе Т7-эндонуклеазы с ПЦР-амплифицированной ДНК из локуса GFP электропорированных клеток. Это необходимо для количественной оценки эффективности разрушения генов GFP. Программное обеспечение ImageJ используется для расчета отношения интенсивностей расщепленных и неразделенных полос для расчета процента спайности.
Эффективность трех различных однонаправляющих РНК, нацеленных на CD45 человека, была проверена в клеточной линии ОМЛ HL-60. Проточная цитометрия показала, что однонаправляющая РНК1 является наиболее эффективной с эффективностью нокаута 98% по сравнению с контролем. Затем нокаут CD45 также выполняется в первичных CD34-положительных HSPC пуповинной крови человека с использованием однонаправляющей РНК1.
Анализ проточной цитометрии показывает почти 80% клеток с потерей CD45 без изменения экспрессии CD34 по сравнению только с Cas9. Для изучения приживления человеческих ГСК с нокаутом CD45 у CD34-положительных ретроорбитально трансфицированных мышей НСГ у CD34-положительных ретроорбитально трансфицированных мышей для анализа, показывающих отредактированные клетки как HLA-ABC-положительные и CD45-отрицательные. После освоения этот протокол может быть завершен за три дня, если его выполнение будет скорректировано.
При попытке выполнить эту процедуру важно помнить о том, что все поверхности и реагенты должны быть свободны от РНКазы, проверять эффективное разрушение генов с помощью нескольких методов и использовать надлежащие экспериментальные методы контроля. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как разрабатывать, синтезировать и трансфицировать рибонуклеопротеины Cas9-sgRNA в гемопоэтические клетки-предшественники для получения быстрого и эффективного разрушения генов.
Обзор
В данной статье описывается протокол быстрого CRISPR/Cas9-опосредованного нокаута генов в первичных гемопоэтических клетках мыши и человека с использованием рибонуклеопротеинового подхода. Этот метод обеспечивает высокую эффективность редактирования при минимальных затратах времени и средств.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Редактирование генов
- Биология гемопоэтических клеток
- Технология CRISPR/Cas9
Теоретические основы
- CRISPR/Cas9 представляет собой мощный инструмент для нарушения функций генов.
- Первичные гемопоэтические клетки имеют решающее значение для изучения гемопоэза.
- Традиционные методы доставки CRISPR могут быть токсичными или медленными.
- Данный протокол направлен на повышение эффективности и снижение затрат.
Цель исследования
- Разработать быстрый и эффективный метод нарушения функции генов.
- Изучить последствия потери генов в гемопоэтических клетках-предшественниках.
- Предоставить протокол, применимый к различным типам клеток.
Используемые методы
- Проектирование одноцепочечных направляющих РНК с помощью CRISPRscan.
- Синтез РНК и подготовка рибонуклеопротеиновых комплексов Cas9-sgRNA.
- Электропорация первичных гемопоэтических клеток комплексами РНП.
- Оценка эффективности разрыва гена с помощью проточной цитометрии и анализа с использованием T7-эндонуклеазы.
Основные результаты
- Достигнуто снижение экспрессии целевого гена в HSPC примерно на 75%.
- Продемонстрирована эффективность нокаута 98% в линии клеток AML HL-60.
- Показано эффективное нарушение функции гена в первичных клетках пуповинной крови человека.
- Подтверждено приживление отредактированных клеток у мышей NSG.
Заключение
- Протокол эффективен и может быть завершен менее чем за неделю.
- Он применим к различным типам гемопоэтических клеток.
- Соблюдение условий отсутствия РНказ является критически важным для достижения успеха.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Эффективный нокаут генов в первичных гемопоэтических клетках позволяет быстро проводить валидацию мишеней и снижать механистические риски при поиске гематологических лекарственных препаратов. Использование рибонуклеопротеинового комплекса CRISPR/Cas9 снижает биологическую неопределенность, обеспечивая высокую эффективность нокаута без введения экзогенной ДНК, что повышает прогностическую достоверность при раннем выборе мишеней. Данный рабочий процесс ускоряет сроки разработки программ в области онкологии и иммунологии, предоставляя масштабируемый и экономически эффективный метод функциональной геномики в релевантных для заболеваний гемопоэтических системах.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишеней
- Научная ценность: Позволяет проверять терапевтические гипотезы посредством быстрого нокаута генов в первичных гемопоэтических клетках-предшественниках мыши и человека.
- Практическая ценность: Способствует снижению биологических рисков, обеспечивая эффективность нокаута до 98% в клеточных линиях ОМЛ и до 80% в первичных HSPC из пуповинной крови человека.
- Стратегическая ценность: Повышает уверенность в выборе мишени и упрощает сортировку портфеля препаратов, позволяя быстро оценивать фенотипы при потере функции гена в релевантных моделях заболеваний.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Подготовка валидированных нокаутных гемопоэтических клеток для последующего скрининга соединений и фенотипического анализа.
- Практическая ценность: Обеспечение стандартизированного, воспроизводимого нарушения работы генов посредством электропорации RNP с количественным анализом методом проточной цитометрии и T7-эндонуклеазным тестом.
- Стратегическая ценность: Возможность масштабируемого использования платформы для первичных клеток, клеточных линий и первичных образцов лейкемии для последовательной валидации мишеней.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: демонстрирует приживление отредактированных гемопоэтических стволовых клеток и клеток-предшественников (HSPCs) человека в мышах линии NSG, что обеспечивает трансляционную преемственность от этапа открытия до доклинической валидации.
- Практическая ценность: предлагает оптимизированный трехдневный рабочий процесс, совместимый с доклиническими сроками проведения исследований по валидации мишеней.
- Стратегическая ценность: снижает неопределенность в отношении механизмов действия гемопоэтических мишеней, позволяя принимать обоснованные с учетом рисков решения о продвижении проектов в области онкологии и иммунологии.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Этот метод интегрируется в континуум поиска от идентификации мишени до оптимизации ведущих соединений, обеспечивая быструю функциональную валидацию гематопоэтических мишеней перед скринингом соединений.
- Фундаментальная биология: обеспечивает проверку гипотез и уточнение сигнальных путей за счет эффективного нарушения функций генов в первичных кроветворных клетках.
- Скрининг: позволяет создавать готовые к анализу нокаутные модели с высокой воспроизводимостью и количественными результатами для достоверной оценки соединений.
- Аналитика: обеспечивает измерение эффективности редактирования с помощью проточной цитометрии и тестов с Т7-эндонуклеазой, что позволяет проводить сравнительный анализ условий.
- Трансляционные исследования: связывает этап поиска с доклинической валидацией посредством продемонстрированного приживления отредактированных HSPCs in vivo.
- Корпоративное повторное использование: создает универсальную платформу CRISPR/Cas9 RNP, применимую для различных кроветворных моделей, что сокращает необходимость в повторной разработке протоколов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышение прогностической уверенности при валидации мишеней, снижение механистической неопределенности и высокоточное нарушение функции генов без интеграции в ДНК.
- Операционная ценность: Стандартизация, воспроизводимость и масштабируемость редактирования генов в первичных и трансформированных гемопоэтических клетках.
- Стратегическая ценность: Улучшение принятия решений о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go), эффективность использования капитала и снижение биологических рисков на поздних стадиях программ разработки гематологических препаратов.
- Влияние на портфель: Приоритизация и решения о продвижении проектов с учетом рисков на основе данных о быстром и высокоэффективном нокауте мишеней.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области молекулярного клонирования, работы с РНК и методов электропорации.
- Необходим доступ к термоциклеру, спектрофотометру, установке для электропорации и системе проточной цитометрии для валидации.
- Требуются условия, свободные от РНаз, и стандартизированная работа с реагентами для обеспечения стабильности РНП и эффективности редактирования.
- Необходима адаптация дизайна направляющей РНК и оптимизация для различных гематопоэтических моделей и целевых генов.
- Практическое ограничение: эффективность может варьироваться в зависимости от типа клеток и целевого локуса, что требует эмпирической валидации для каждого интересующего гена.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:05
Title
1:05
sgRNA Fwd Primer Design, DNA Template Synthesis, and ln Vitro Transcription of sgRNA
3:38
Cas9-sgRNA Complexing and Electroporation
5:45
Results: Use of Cas9-sgRNA Electroporation Protocol to Study Efficient Knockout of Target Gene
7:48
Conclusion
