Корректура и ДНК ремонт пробирного анализа единичных нуклеотидных расширение и MALDI-TOF масс-спектрометрии с помощью

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области точности полимеров ДНК и репарации ДНК, такие как методы корректуры и анализа, а также в определении участка для репарации ДНК. Главное преимущество этой методики в том, что она очень специфична, проста, быстра и удобна в исполнении. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, могут испытывать трудности из-за того, что они все еще занимаются репликацией ДНК и репарацией, могут быть не знакомы с инструментами масс-спектрометрии и интерпретацией данных.

Я думаю, что самое важное заключается в том, что визуальная демонстрация очень важна, поскольку мы можем показать, как наша коммерчески разработанная масс-спектрометрия для клинических применений, таких как мутация и депутация, может быть удобно адаптирована для корректуры ДНК и исследования репарации. Демонстрировать процедуру будут аспиранты Жун-Сюань и Куэй-Чин из моей лаборатории. Начните эту процедуру с подготовки грунтовки и шаблона, как описано в текстовом протоколе.

В качестве примера для корректуры возьмем TG несоответствие подложки P21 и T28. Разведите грунтовку Р21 и матрицу Т28 до 12,5 пикомолев на микролитр с водой. Затем перелейте 12 микролитров разведенного праймера и 12 микролитров разведенного шаблона в стерилизованную микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров.

Плотно закрыв трубку, инкубируйте трубку в течение 30 минут на закрытой водяной бане с температурой 65 градусов Цельсия. Затем инкубируйте в течение 30 минут на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия. И, наконец, поместите трубку на лед, чтобы обеспечить надлежащий отжиг.

В стерилизованную микроцентрифугу объемом 1,5 миллилитра добавьте восемь микролитров смеси праймера и шаблона, два микролитра 10-кратного реакционного буфера для корректуры, четыре микролитра смеси 4ddNTP и воду до 18 микролитров. Переведите тюбик для смешивания. Разведите ДНК-полимеразу в ледяном 1-кратном реакционном буфере для корректуры до желаемой концентрации.

Разведенный фермент всегда храните на льду. Предварительно прогрейте микроцентрифужную пробирку со смесью подложки до желаемой температуры реакции. Затем перенесите два микролитра разведенной ДНК-полимеразы в предварительно нагретую смесь субстрата и переверните пробирку, чтобы перемешать ее содержимое.

Центрифугируйте пробирки с ферментом и подложкой в течение нескольких секунд при 3200-кратной гравитации при температуре окружающей среды, чтобы замедлить компоненты реакции. Немедленно перенесите реакцию на нагревательный блок или водяную баню при нужной температуре инкубации. Чтобы завершить реакцию, добавьте равное количество буферизованного фенола и перемешайте реакцию, вортексируя в течение нескольких секунд.

Затем центрифугируйте реакцию в микроцентрифуге при 3200-кратном давлении при температуре окружающей среды в течение пяти минут. Перенесите водную фазу в чистую микроцентрифужную пробирку и добавьте равное количество хлороформа. После смешивания путем вортексирования в течение нескольких секунд центрифугируйте образец в микроцентрифуге при 3200-кратном давлении при температуре окружающей среды в течение трех минут.

Перенесите водную фазу в чистую микроцентрифужную пробирку. После инкубации реакции при температуре 95 градусов Цельсия в течение пяти минут поместите пробирку на лед. Затем выполните дополнительное применение смолы для устранения солевого загрязнения в планшете 384 лунки, как подробно описано в текстовом протоколе.

Установите планшеты с образцами в нанолитровый дозатор. Поместите матричный чип и подготовленную пластину на 384 лунки в соответствующий лоток. Управляйте нанодозатором, чтобы обнаружить продукты реакции на чипе.

Нажмите кнопку запуска на сенсорном экране нанодозатора, чтобы начать. Проверьте автоматически захваченное изображение пятен образца, содержащее информацию о насыщенности на экране, чтобы убедиться, что общий пятнистый объем на чипе составляет от пяти до 10 нанолитров. Повторите взятие образца, если объем недостаточен.

Подготовьте файл в формате Excel, содержащий информацию о предполагаемом сигнале для импорта. Создайте и определите новый пробу в прикладной программе, щелкнув правой кнопкой мыши по импорту группы проб в формате дизайнера и выбрав файл Excel. Определите целевую пробирную пластину с помощью дерева опций пластины проекта клиента в левой части экрана, щелкнув правой кнопкой мыши верхнюю часть дерева и присвоив ей имя файла.

Выберите тип планшета на 384 лунку и нажмите OK. Появится пустая пластина. Выберите подходящий анализ в левой части экрана. Назначьте выбранный анализ для каждой позиции пятнистого образца на чипе, выделив лунку и щелкнув правой кнопкой мыши, чтобы выбрать «Добавить плекс».

Далее подготовьте рабочий список всех тестов на чипе в формате Excel без заголовка. Импортируйте рабочий список с помощью опции «Добавить новый пример проекта». Назначьте тест и рабочий список для каждой позиции теста P21T28 и выберите их, щелкнув правой кнопкой мыши.

Свяжите масс-спектрометр с чипом с помощью прикладной программы. Выберите настройку по умолчанию в правой части экрана. Введите название теста и идентификатор чипа в углу чипа.

Сохраните настройки и запустите программу управления MS. Нажмите кнопку входа/выхода и выньте скаутскую пластину. Поместите пятнистый чип на скаут-пластину и нажмите кнопку входа/выхода, чтобы пятнистый чип вошел в масс-спектрометр.

Нажмите кнопку «Захватить» в прикладной программе, чтобы запустить масс-спектрометрию и получить данные. Откройте программу для анализа данных. Просмотрите дерево базы данных в верхнем левом углу и выберите идентификатор чипа.Откройте файл данных в правой части экрана.

Нажмите на значок спектра, чтобы отобразить масс-спектр. Чтобы обрезать определенный диапазон массы сверхзарядки, щелкните правой кнопкой мыши, чтобы выбрать диалоговое окно настройки. В новом окне нажмите на ось x и установите желаемый верхний и нижний предел и нажмите OK, чтобы показать указанный диапазон спектра.

Экспортируйте спектр для ведения учета, щелкнув правой кнопкой мыши по экспорту. Выберите тип файла JPEG, нажмите на пункт назначения, выберите обзор диска, введите имя файла, а затем нажмите на экспорт. Для количественной оценки данных используйте курсор и нажмите на вершину, чтобы показать высоту пика в верхнем левом углу.

В МС MALDI-TOF существует обратная зависимость между пиковой интенсивностью в массе олигонуклеотидов. Олигонуклеотиды от 17 до 24 нуклеотидов были подвергнуты анализу МС. Относительная интенсивность сигнала была рассчитана и может быть использована для количественной оценки корректуры или ремонтного анализа.

В масс-спектре можно найти как шаблонные, так и праймерные сигналы. Из-за разницы в размерах сигналы от шаблонов и их неспецифических продуктов частичной деградации были хорошо отделены от несовпадающих грунтовок и корректурных изделий. Здесь показана корректура трех простых терминалов TG.At пяти минут, скорректированное произведение составило 23% против 17% для иссекательного продукта.

Эта разница продолжала увеличиваться до 69% против 14% через 20 минут. Обратите внимание на высокое разрешение MS, четко разделяющее подводный прямой сигнал и сигнал продукта с разницей в массовом заряде всего 32. Также легко разрешимыми были две формы продуктов иссечения для пера: конечная корректура TG.

Один промежуточный продукт эксцизионной эксцизии нуклеотидов и два продукта эксцизии. Корректура внутренних несоответствий показала четкую тенденцию к эффективности корректуры. Как свидетельствует большая корректура произведения, повышенная эффективность наблюдалась, когда субстрейты имели несоответствия на последнем, предпоследнем, третьем и четвертом нуклеотидах от трех простых концов, по сравнению с несоответствиями в других позициях.

После освоения этой техники ее можно выполнить за четыре часа, если она выполнена правильно. После этой процедуры можно выполнять другие приложения, такие как полимерный корректурный скрининг, для обнаружения и изобретения нового лекарства для фармацевтических исследований. Этот метод также прокладывает путь для исследователей в области репликации и восстановления ДНК, чтобы получить больше информации о медицине гномов и ее точном воспроизведении для всех живых организмов.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как выполнять корректуру ДНК и анализ репарации с помощью масс-спектрометрического анализа MADI-TOF. Не забывайте, что работа со сфенохлороформом может быть опасной, и во время выполнения процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение средств индивидуальной защиты. Альтернативный протокол в тексте можно рассматривать в качестве более безопасной замены.