Стереотаксическая приемных передачи цитотоксических иммунокомпетентных клеток в мышиных моделях ксенотрасплантатов глиобластомы мультиформной ортотопическая человека

Мультиформная глиобластома остается наиболее частой и агрессивной первичной опухолью головного мозга у взрослых. Несмотря на агрессивное лечение, основанное на хирургическом вмешательстве с последующей радиотерапией и химиотерапией, ГБМ ассоциируется с чрезвычайно плохим прогнозом и медианой выживаемости ниже 15 месяцев. Поскольку за последнее десятилетие было достигнуто мало терапевтических достижений, в настоящее время исследуются клеточные иммунотерапии, направленные на устранение высокоинвазивных и резистентных клеток GBM, которые могут быть вовлечены в быстрый рецидив опухоли.

Введение выбранных GBM-реактивных цитотоксических иммунофакторов в непосредственной близости от опухоли может представлять собой уникальную возможность для доставки концентрированной клеточной иммунотерапии непосредственно в область остаточного злокачественного новообразования. Наша группа недавно показала, что иммунодефицитные мыши NSG, несущие ортотопический первичный человеческий GBM, ксенотрансплантат, повторяют GBM для большего развития у пациентов. Эти модели GBM были использованы для оценки эффективности цитотоксических иммунных эффекторов при внутриопухолевых инъекциях.

Этот протокол описывает наш терапевтический процесс, основанный, во-первых, на выделении и амплификации ГБМ-реактивных иммунных эффекторных клеток. Во-вторых, размножение этих эффекторных клеток для межчерепной инъекции. И в-третьих, их стереотаксическая инъекция в место опухоли в мозге мыши.

Также было исследовано поведение иммунного эффектора после ортотопической инъекции. Через три недели после стимуляции плода с помощью PHA эффекторные клетки, образующие скопление клеток на дне колбы, должны вернуться в состояние покоя и быть готовыми к использованию. После проверки количества эффекторных клеток ресуспендировать и собрать клетки в пробирку объемом 115 миллилитров и центрифугировать их.

Аккуратно и полностью удалите надосадочную жидкость. И ресуспензировать клетки в стерильных PBS и центрифуге для их промывания. Аккуратно и полностью снимите надосадочную жидкость.

А затем ресуспендировать клетки в одном миллилитре стерильного PBS. Переведите клетки в микропробирку для центрифугирования. Снова осторожно и полностью снимите надосадочную жидкость путем пипетирования медленно.

Следующий шаг имеет решающее значение: ресуспендировать клетки в половине конечного объема стерильного PBS и мягко и осторожно гомогенизировать. Проверьте конечный объем с помощью микропипетки, окончательный объем на одну мышь должен составлять от 15 до 20 микролитров на 20 миллионов клеток. Будьте уверены, он не превысит 20 микролитров на одну мышь.

Держите клетки на льду до инъекции. Убедитесь, что животное адекватно обезболито, ущипнув палец ноги, а затем удалите шерсть с места операции, между двумя ушами и до носа. Медленно суспендируйте клетки, чтобы предотвратить слипание клеток, и загружайте суспензию ячеек в шприц с большой осторожностью, чтобы избежать присутствия пузырьков.

Затем поместите шприц в адаптированный шприцевой насос. Продезинфицируйте место операции солью и 5% раствором повидон-йода и заложите в глаза мыши смазывающую офтальмологическую мазь, чтобы предотвратить высыхание роговицы. Затем расположите мышь под наркозом на стереотаксической рамке на теплом блоке.

Правильно расположите нос и зубы мыши над зубчатым стержнем. Плотно затяните ушные планки в ушах мыши, чтобы обездвижить голову. Будьте осторожны, чтобы не повредить барабанные перепонки, не нарушить дыхание и убедиться, что голова хорошо обездвижена.

Сделайте сагиттальный разрез кожи по средней линии стерильными ножницами вдоль верхней части черепа, чтобы обнажить череп. Определите пересечение сагиттальной и корональной структур, которые будут служить ориентирами для стереотаксической локализации, и поместите шприц выше этой точки. Переместите шприц по заданным координатам.

На два миллиметра справа боковой, и на 0,5 миллиметра спереди с помощью микросверла сделайте небольшое отверстие в черепе стерильным сверлом. Будьте осторожны и оставайтесь поверхностными, чтобы избежать травмы головного мозга. Осторожно введите шприц в просверленное отверстие.

Медленно переместите иглу вперед на три миллиметра вниз в твердую мозговую оболочку, а затем назад на 0,5 миллиметра до конечной глубины 2,5 миллиметра для введения клеток. Вводите клеточную инъекцию со скоростью два или три микролитра в минуту и следите за мышами на протяжении всего времени инъекции. После завершения инъекции извлеките иглу всего на один миллиметр и удерживайте шприц на месте еще минуту, прежде чем медленно полностью извлечь шприц, чтобы предотвратить утечку из места инфузии.

Осторожно извлеките животное из стереотаксической рамки. Закройте кожу подходящим хирургическим швом и нанесите 2% гель Лидокаин непосредственно на рану. Перенесите мышь под наркозом в соответствующую клетку над грелкой, установленной на 37 градусов Цельсия, чтобы поддерживать соответствующую температуру тела мыши до полного восстановления после анестезии.

Поскольку суспензия очень концентрирована, проверяли жизнеспособность и реакционную способность клеток. Эффекторные клетки загружали в шприц для имитации инъекции in vivo. Клетки собирали сразу или через 10 минут и анализировали с помощью проточной цитометрии на окрашивание йодидом пропидия.

Как видим, подготовка и загрузка не повлияли на жизнеспособность эффекторных клеток через 24 часа. Реактивность против опухолевых клеток глиобластомы также проверялась с использованием либо неподготовленных клеток, либо эффекторов, приготовленных и остававшихся на глазах в течение трех часов. Реактивность контролируется путем положительного окрашивания маркера активации CD107A.

Эти результаты показывают, что препарат не влиял на реактивность эффекторных клеток. Через семь дней после введения эффекторных клеток мозг мышей был собран, разрезан и окрашен для гематической окраски, чтобы можно было идентифицировать структуру опухоли. Затем античеловеческое окрашивание CD3 позволило локализовать эффекторные клетки.

Интересно, что эффекторные клетки были обнаружены вокруг опухоли и в ядре опухоли, а также в контралатеральном полушарии. Человеческие эффекторные Т-клетки, выделенные из мозга мыши через 48 часов после инъекции, составляют 2% клеток мозга. Они по-прежнему были способны к пролиферации в присутствии PHA, фидеров и стимуляции IL2 с чистотой 99% после амплификации.

Благодаря этому протоколу покоящиеся эффекторные клетки человека могут выживать и патрулировать паренхиму мозга мыши в течение нескольких дней после стереотаксической инъекции. В заключение следует отметить, что адоптивный перенос человеческих эффекторных клеток с помощью стереотаксических инъекций представляет собой многообещающий подход к эффективному лечению инфильтративных злокачественных опухолей головного мозга с ограниченным вредным воздействием на здоровые клетки. Этот способ введения позволяет получить преимущество в том, что клетки человека доставляются близко к месту опухоли, что ограничивает их разведение в тканях и организме.

Здесь мы описали процедуру доставки большого количества иммунных клеток в опухоль головного мозга без вредного воздействия на эффекторные клетки и, что важно, без видимого вредного воздействия на мышей. Более того, локально инъецируемые иммунные клетки в мозге мыши способны не только выживать и сохранять свою способность к активации и амплификации ex vivo, но также устранять диссеминированные опухолевые клетки в окружающих тканях мозга. В совокупности эти особенности необходимы для того, чтобы обеспечить элиминацию сильных инфильтративных опухолевых клеток, которые характеризуют опухоли GBM.

Этот протокол открывает новые возможности для создания процедуры адоптивного переноса на мышиной модели опухоли головного мозга. Важный шаг перед рассмотрением клинической БК.