Калибровка бесплатно в Vitro количественная оценка белка гомо олигомеризации с использованием коммерческих приборов и свободным, открытым исходным кодом программное обеспечение для анализа яркости

Этот протокол описывает бесплатная калибровка подход для количественного определения белка гомо олигомеризации в vitro основанные на страницу отдела Флуоресценция колебаний с помощью коммерческого свет, сканирующая микроскопия. Показаны правильные приобретения параметры и методы анализа.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области скрининга лекарств, такие как выяснение влияния низкомолекулярных ингибиторов на очень низкие концентрации белок-белковых взаимодействий. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она не требует калибровки, может быть реализована в любом конфокальном микроскопе и использует очень небольшое количество меченых белков. Применение этого метода распространяется на разработку противораковых препаратов, низкомолекулярных ингибиторов и различных ингибиторов слияния, поскольку он предоставляет количественную информацию о белок-белковых взаимодействиях.

Хотя этот метод может дать представление о белковых взаимодействиях и агрегациях in vitro, он также может быть применен к другим системам, таким как динамика белков живых клеток и межклеточные взаимодействия. Для начала трансформируйте pLysS-клетки с помощью вектора pET-22b, содержащего мономеризованный человеческий FKBP12 и N-концевые метки His6 и mVenus. После того, как клетки оправятся от инкубации и теплового шока, поместите их на LB-агар с добавлением антибиотиков.

Пересадите преобразованные колонии в 100-миллилитровую закваску LB и выращивайте от 16 до 20 часов при температуре 37 градусов Цельсия с встряхиванием. После инкубации разбавьте плотную закваску от одного до 100 в среде LB двумя партиями по 500 миллилитров. Затем выращивайте в течение двух-трех часов оптическую плотность на уровне 600 нанометров от 0,6 до 0,8.

После охлаждения культур на льду индуцируйте выработку белка с помощью 250-микромолярной ИПТГ. Выращивайте культуры от 16 до 20 часов при температуре 21 градус Цельсия и 200 оборотах в минуту. Затем соберите клетки центрифугированием при массе 2 000 г в течение 20 минут.

Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 40 миллилитрах буфера А IMAC с добавлением ингибиторов протеазы, не содержащих ЭДТА. Теперь произведите ультразвуковую обработку элементов мощностью 500 Вт, 20 килогерц и амплитудой 40% при девяти секундах включения, 11 секунд выключения на 15 минут на льду. После ультразвуковой обработки растворимый материал соберите методом центрифугирования при 20 000 г в течение часа при четырех градусах Цельсия.

Переложите растворимый лизат в коническую колбу, и добавьте два миллилитра смолы TALON. Дайте суспензии инкубироваться в течение одного часа при обороте 105 об/мин. Теперь соберите смолу и промойте ее 250 миллилитрами буфера IMAC A, а затем 500 миллилитрами белка буфера IMAC B. Elute His6-меченый белок с использованием буфера IMAC C. Введите элюат в предварительно уравновешенную колонку исключения размера и соберите пик FKBP12, который вымывается примерно на уровне 87,7 миллилитров.

Оцените чистоту белка с помощью SDS-PAGE, а также объедините и сконцентрируйте по мере необходимости. Чтобы настроить многолуночный планшетный массив, сначала приготовьте раствор 100-наномолярного очищенного FKBP12 в том же буфере, который используется для эксклюзионной хроматографии. Ультразвуковая обработка и центрифуга с быстрым отжимом 13 000 об/мин для предотвращения образования агрегатов.

Теперь пипетка нанесет от 100 до 200 микролитров разбавленного белка в восьмилуночную камеру наблюдения со стеклянным дном. Добавьте димеризатор BB до конечных концентраций 10, 20, 40, 80, 100, 150, 300 и 500 наномоляров. В качестве образца приготовьте раствор только 100-наномолярной mVenus для оценки потенциальных эффектов агрегации и осаждения, а также для восстановления значения яркости для мономера с теми же настройками регистрации.

Может быть использована любая конфокальная система светового сканирующего микроскопа, оснащенная цифровыми детекторами или хорошо охарактеризованными аналоговыми детекторами и способная поддерживать постоянное время пребывания для каждого полученного пикселя. Выберите корректирующий объектив для коррекции воды с помощью кольца, предназначенный для флуоресцентной корреляционной спектроскопии. Теперь добавьте каплю воды в цель для коррекции ошейника для погружения в воду.

Установите на сцену камеру наблюдения с восемью лунками. Задайте траекторию луча возбуждения, включив 514-нанометровый лазер и установив его мощность от 20 до 100 нановатт на выходе из объектива. Включите один HyD-датчик.

Предпочтительны детекторы, способные подсчитывать фотоны. Выберите окно излучения от 520 до 560 нанометров. Для режима съемки используйте формат 16 на 16 пикселей.

Установите время задержки пикселей таким образом, чтобы время кадра было больше, чем диффузия белка, а время задержки пикселей было намного короче. Это соответствовало установке времени задержки примерно в 13 микросекунд для системы, использованной в этой демонстрации. Установите отверстие на одну единицу Эйри для соответствующего излучения примерно 545 нанометров.

Выберите режим сбора данных по времени xy и выберите количество кадров, которые должны быть получены для одного захвата и скважины. Теперь установите размер пикселя примерно на 120 нанометров. Если система оснащена высокопроизводительным режимом, введите координаты каждой скважины и количество заборов на скважину для автоматизации процесса.

Если система оснащена системой перфузии, загрузите раствор BB и запрограммируйте перфузию на начало сразу после 5 000-го кадра, чтобы оценить кинетику димеризации при получении 10 000 изображений. Выберите правильную скважину и сосредоточьтесь на решении. Затем начните получение изображения и сохраните полученную стопку изображений в формате TIFF.

Были получены последовательности из 20 000 изображений очищенной FKBP12 mVenus в 100-нанометровом растворе, как указано в разделе протокола. Интенсивность первого кадра отображается вместе со средним профилем интенсивности изображения без тренда. Также показана яркость без и с плавной фильтрацией.

После того, как было получено 10 000 кадров, в раствор при приобретении добавляли препарат гомодимеризатора BB. Анализировалась каждая последовательная серия из 5 000 кадров. Средняя яркость через пять минут после добавления BB составила 1,010, что является двукратным увеличением, указывающим на димер FKBP12.

Кинетика процесса показывает задержку между добавлением BB и полной димеризацией FKBP12 примерно в две минуты. Ключевым аспектом для оценки белок-белковых взаимодействий in vitro является производство и очистка меченого белка. Убедитесь, что у вас есть небольшое количество меченого белка, представляющего интерес, и что ваш белок не агрегируется согласно вашему анализу.

После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как поверхностный плазмонный резонанс или флуоресцентная корреляционная спектроскопия, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как константы диссоциации или коэффициенты диффузии. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области биофизики к детальному изучению белковых взаимодействий в живых клетках. Не забывайте, что работа с реагентами для очистки белка может быть крайне опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как защитные очки, перчатки.