Фиксация легких под постоянным давлением для оценки эмфиземы у мышей
26 сентября 2019 г.
Здесь представлен полезный протокол для фиксации легких, который создает стабильное состояние для гистологического оценивания образцов легких по мышиной модели эмфиземы. Основным преимуществом этой модели является то, что она может исправить многие легкие с тем же постоянным давлением без коллапса легких или дефляции.
Постоянное давление в устройстве фиксации поддерживает легкие в достаточно завышенном состоянии генерации гистологического образца легких подходит для оценки мягкого сигаретного дыма индуцированной эмфиземы. Основным преимуществом этой модели является то, что она может исправить многие легкие в то же время, используя то же постоянное давление без коллапса легких или дефляции. Демонстрация процедуры будет Наоко Арано аспирант из моей лаборатории.
После подтверждения отсутствия реакции на рефлекторное движение сделайте разрез в коже и мышечной ткани вдоль медиальной линии мыши, направленной на цефалическую область, и вырежьте боково, чтобы создать более широкое рабочее пространство. После разоблачения диафрагмального слоя прокалывают ткань мипсами и открывают грудное пространство. Отрежьте стернаную область, позволяющую визуализировать легкие и сердце.
И вырезать левый атриум и правый желудочек. Вставьте канюлю 24 калибра, соединенную с перфузионной насосом, в правый желудочек и навелите канюлю на головную область, пока не достигнет легочной артерии. Затем включите насос и пронизать ткани с примерно 200 миллилитров PBS в течение одного часа, пока все ткани легких изменилась на белый цвет.
В конце перфузии вырезать соединительной ткани, окружающие трахеи, легких и сердца, и использовать шов, чтобы связать право основных бронхов. Затем собери все отдельные доли правого легкого и поместите сердце и доли левого легкого в отдельные 10 миллилитровых шприцев, содержащих соответствующую фиксацию. Увягать поршень создания вакуума в шприце, чтобы надуть легкие и удалить легкое из шприца.
Вставьте 20 калибровочных канюле в трахею и используйте шов для обеспечения канюлы на месте. Подключите один миллилитровый шприц, наполненный фиксатором, к канюле и заполните легкое дополнительным фиксатором для проверки на наличие утечек. Убедитесь, что место вставки было обеспечено, чтобы предотвратить отсоединение образца легких от легочной доски во время фиксации.
Затем перенесите ткань на оборудование давления фиксации легких, удалив образец и связав трахею узлом в конце периода фиксации. Нижний компонент оборудования давления фиксации легких, в которое вставляется образец легких, соединен через 20 калибровочных канюли с кончиком потока формалина с трехвалютным стопкоком. Давление генерируется из различных уровней поверхности фиксатора между нижним и верхним отсеками.
Разница в давлении составляет 25 сантиметров воды, но ручка регулировки высоты может быть использована для регулировки давления до 25-30 сантиметров воды. Насос соединяет нижние и верхние контейнеры, сохраняя 25-сантиметровую разницу в фиксаторной высоте поверхности, и направляет поток агента. После 48 часов фиксации легкие мышей SMP30, подвергшихся воздействию окружающего воздуха, не демонстрируют заметного расширения воздушного пространства.
Значительное расширение воздушного пространства и разрушение альвеолярной стены, однако, наблюдаются у мышей SMP30, подвергшихся воздействию хронического сигаретного дыма. Кроме того, средний линейный перехват и разрушительный индекс легких образцов значительно больше в дыме подвергаются SMP30 нокаут мышей, чем в воздухе подвергаются животных. Наша лаборатория использует 10%формалин, но исследователи могут использовать другие агенты фиксации в соответствии с их экспериментальными потребностями.
Как мы уже сообщали с помощью продемонстрированой системы фиксации легких образцы могут быть собраны из различных моделей эмфиземы мыши для их морфометрической оценки. Как фиксируя вещества могут быть опасны всегда носить соответствующее защитное оборудование персонала и работать в хорошо проветриваемой комнате.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе описан метод фиксации легких, обеспечивающий стабильные условия для гистологической оценки образцов легких мышиной модели эмфиземы. Этот метод позволяет проводить фиксацию нескольких легких одновременно, предотвращая их спадение или дефляцию.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Биология
- Гистология
Обзор
- Эмфизема — это заболевание легких, которое часто вызывается воздействием сигаретного дыма.
- Гистологическая оценка имеет решающее значение для понимания патологии легких.
- Поддержание расправления легких во время фиксации необходимо для точной оценки.
- Данный протокол посвящен решению проблем, возникающих при использовании методов фиксации легких.
Цель исследования
- Представить надежный метод фиксации легких.
- Облегчить оценку образцов легких в исследованиях.
- Повысить согласованность гистологического анализа моделей эмфиземы.
Используемые методы
- Использование фиксирующего устройства для поддержания постоянного давления.
- Разрез по срединной линии тела мыши для доступа к грудной полости.
- Прокол диафрагмы для открытия грудного пространства.
- Визуализация легких и сердца для забора образцов.
Основные результаты
- Успешное поддержание раздутого состояния легких во время фиксации.
- Возможность одновременной фиксации нескольких легких.
- Стабильные гистологические образцы, пригодные для анализа.
- Демонстрация процедуры аспирантом.
Выводы
- Данный протокол представляет собой надежный метод фиксации легких.
- Он повышает качество гистологической оценки в исследованиях.
- Этот метод может быть применен в различных исследованиях патологии легких.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для отрасли
Стабильная фиксация легких при постоянном давлении решает критическую проблему в доклинических моделях респираторных заболеваний, обеспечивая воспроизводимую гистологическую оценку эмфиземы у мышей. Данный метод способствует надежному морфометрическому анализу, снижая вариабельность и повышая прогностическую достоверность при валидации мишеней на ранних стадиях исследований ХОБЛ. Возможность одновременной обработки нескольких образцов оптимизирует сравнительные исследования и позволяет принимать обоснованные решения по отбору проектов в портфеле разработок.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Обеспечивает стандартизированную морфометрическую оценку степени тяжести эмфиземы на мышиных моделях.
- Поддерживает функциональную валидацию потенциальных мишеней за счет обеспечения воспроизводимой архитектуры тканей.
- Способствует снижению биологических рисков путем минимизации артефактов, вызванных фиксацией.
- Повышает прогностическую точность при установлении связи между гистологическими конечными точками и механистическими гипотезами.
Скрининг и разработка анализа
- Подготовка валидированных образцов легких для последующих количественных гистологических анализов.
- Обеспечение воспроизводимости и сопоставимости результатов между экспериментальными когортами.
- Поддержка масштабируемой обработки нескольких образцов в идентичных условиях.
- Возможность надежной оценки влияния соединений на структуру легких в рамках скрининговых кампаний.
Трансляционные и доклинические исследования
- Приводит доклинические модели патологии легких в соответствие с конечными точками, релевантными заболеванию, для трансляционных исследований.
- Обеспечивает непрерывность процесса от этапа открытия до доклинической валидации за счет стандартизации подготовки тканей.
- Снижает риск получения артефактных результатов, которые могут исказить оценку биомаркеров или эффективности.
- Обеспечивает принятие решений о дальнейшем продвижении проекта с учетом рисков на основе достоверных гистологических данных.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод фиксации при постоянном давлении интегрируется в процесс раннего поиска и доклинической валидации, поддерживая как валидацию мишеней, так и поиск перспективных соединений-лидеров в моделях респираторных заболеваний.
- Открывательная биология: обеспечивает надежное сохранение архитектуры тканей для проверки гипотез и анализа сигнальных путей в моделях эмфиземы.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимые количественные гистологические результаты для оценки соединений.
- Аналитика: позволяет проводить морфометрические измерения, такие как средний линейный перехват и индекс деструкции, для сравнительного анализа.
- Трансляционные исследования: способствует сопоставлению доклинических данных с клинической патологией эмфиземы в соответствующих случаях.
- Корпоративное повторное использование: предлагает стандартизированный метод фиксации, который можно адаптировать для различных моделей заболеваний легких у мышей.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозов и валидацию мишеней за счет минимизации вариабельности фиксации.
- Операционная ценность: Увеличивает пропускную способность и стандартизацию, обеспечивая одновременную фиксацию нескольких образцов.
- Стратегическая ценность: Улучшает качество принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и эффективность использования капитала за счет обеспечения надежных гистологических конечных точек.
- Влияние на портфель: Облегчает приоритезацию программ по респираторным заболеваниям с учетом рисков на основе достоверных данных о тканях.
Рекомендации по внедрению
- Требуется опыт проведения хирургических операций на мышах и работы с легочной тканью.
- Необходимо специализированное оборудование для фиксации, способное поддерживать постоянное давление.
- Для обеспечения воспроизводимости требуется стандартизация параметров фиксации между исследовательскими группами.
- Метод может быть адаптирован под различные фиксаторы в зависимости от требований эксперимента.
- Необходимо соблюдение протоколов безопасности при работе с опасными фиксирующими агентами.
