Обнаружение и мониторинг опухолев, связанных с циркуляцией ДНК в биожидкости пациентов

Этот протокол позволяет обнаруживать связанные с опухолью мутации и в настоящее время дополняет инвазивные хирургические процедуры. Еще одной силой является возможность использовать этот протокол для мониторинга опухолевой мутации нагрузки сверхурочно. Техника позволяет генотипирование опухоли, не требуя фактической биопсии хирургической ткани, которая особенно полезна для опухолей в сложных местах, таких как ствол мозга с ограниченным доступом к тканям.

При отсутствии повторной биопсии, продольные молекулярные данные не доступны для комплимент МРТ. Цифровой мониторинг ПЦР облегчает молекулярную добавку к диагностике, позволяя более информированный процесс принятия решений лечения. Аналогичные методы могут быть использованы для обнаружения экспрессии генов, в частности системы, с обычными Флуо-4 и утоление связанных зондов, но с более высокой чувствительностью, чем с количественным ПЦР.

Перед началом капельки цифровой процедуры ПЦР, очистить скамейку пространства и оборудования с 10%bleach и 70% этанола и осторожно вихрь и кратко центрифуги все реагенты, за исключением капельного стабилизирующего масла. Подтвердите, что сжатый газовый баллон с азотом крепится к инструменту генерации капель и что цилиндрический бак установлен на уровне 90 фунтов на квадратный дюйм. И 38 микролитров цифровой смеси реакции ПЦР непосредственно в нижней части каждой колодец из восьми хорошо ПЦР трубки полосы, удаление любых пузырьков с чистой наконечником пипетки.

Добавьте 12 микролитров предварительно усиленного образца ДНК в трипликат к соответствующим скважинам трубчатой полосы. Аккуратно пипетка полный объем 10 раз, чтобы смешать смесь реакции с образцом ДНК и пипетки полный объем от каждого хорошо в соответствующие каналы H капли генерирующих чип инструмента. Вставьте новую полосу трубки ПЦР в прибор для генерации капель и сканируйте идентификатор чипа капельного инструмента в программное обеспечение на приборной компьютере.

Затем нажмите Кнопку Запуска, чтобы начать капельные образцы. Когда капля завершена, удалите полосу ПЦР трубки и нанесите крышки полосы трубки. Перенесите трубчатую полосу на тепловой циклер и сбалансируете трубку с другой трубчатой полосой, содержащей 80 микролитров воды на колодец.

Затем запустите тепловой велосипедист в соответствующих условиях теплового велоспорта. Замените крышки полосы на высокоскоростные колпачки. Когда тепловой цикл будет завершен, перенесите трубчатую полосу на прибор количественной оценки, нажмите Кнопку Настройка запуска на программном обеспечении прибора и поместите полосу трубки в инструмент количественной оценки.

Поместите металлический щит поверх нового чипа прибора количественной оценки, сканируйте идентификатор чипа в прибор и вставьте чип в машину. Закройте крышку инструмента. В компьютерном программном обеспечении введите имя для запуска цифрового PCR и для каждого из восьми каналов, затем выберите Быстрый режим и нажмите Кнопку Начать, чтобы начать количественную оценку.

Чтобы проанализировать необработанные спектральные данные, запустите программное обеспечение аналитика и откройте файлы fcs. При анализе зрения, выберите нетронутыми. При просмотре образца нажмите на коробки рядом с каждым из восьми образцов.

Программное обеспечение будет график сигналов для мутантов и диких аллелей типа вдоль х и у оси соответственно. Используйте функцию вычисленной матрицы, чтобы подать заявку на спектральную компенсацию на нетронутых каплях, в соответствии с инструкторами производителей и настроить настройки оси под вариантами оси. Установите ось x до минимума нуля и максимум 30 000, а ось y как минимум до минус 5 000 и максимум 10 000.

Когда скопления капель были определены, отрегулируйте ось, чтобы уменьшить пустое пространство на графике. Выберите образец, соответствующий положительному контролю геномной ДНК опухолевых тканей, чтобы установить отрицательные ворота мутанта и дикого типа, гарантируя, что кластеры отличаются и легко идентифицируются. Затем нажмите правой кнопкой мыши и выберите Применить все настройки к выбранным образцам, чтобы применить настройки ворот для положительного контроля для всех образцов.

В графическом представлении щелкните несколько образцов для просмотра участков для всех выбранных образцов и экспортировать изображение в качестве файла tif. Затем в рамках Workspace выберите экспортный анализ и сохраните анализируемый файл данных в качестве файла csv. Здесь показаны репрезентативные результаты успешного выявления мутации в предварительно усиленной плазме и клеток спинномозговой жидкости, свободных от ДНК двух детей с диффузными глиомами средней линии.

В этом эксперименте можно наблюдать четкое разделение скоплений мутантов и диких типов соответственно по оси x и y. Надежные кластеры дикого типа указывают на то, что экстракция ДНК без клеток была успешной, потому что шаблон ДНК присутствует. Для этих пациентов кластеры мутантов показывают частоту мутации 1,6 и 39,32 процента для образцов плазмы и спинномозговой жидкости соответственно в соответствии со статусом мутации опухоли, подтвержденным геномным анализом биопсии опухолевой ткани.

Отрицательный контроль, с другой стороны, показывает нулевой мутант и ноль капель дикого типа, указывающих на отсутствие загрязнения смеси реакции ПЦР. Положительный контроль геномной ДНК опухолевых тканей показывает, что мутация обнаруживается на ожидаемой аликальной частоте для выбранного образца опухоли. Отсутствие обнаружения мутаций в плазме не может быть необходимым означает, что пациент является диким типом для мутации интереса, как ложные негативы происходят.

Например, у этого пациента, хотя мутация интереса не была обнаружена, состояние мутации было подтверждено геномным анализом опухолевой ткани. ПЦР является очень чувствительным методом, который требует частого обеззараживания рабочей зоны и оборудования, чтобы избежать получения ложноположимых данных.