Простой подход к выполнению измерений TEER с использованием самодельного Вольт-Ампереметра с программируемой частотой вывода
5 октября 2019 г.
Здесь мы демонстрируем, как настроить недорогой вольт-ампереметр с программируемой частотой вывода, который может быть использован с коммерчески доступными электродами палочки для трансэпителиальных/эндотелиальных измерений электрического сопротивления.
Измерение трансэпителиального электрического импульса используется с 1980-х годов для определения слияния и барьерной функции эпителиальных монослой в клеточной культуре. Основной метод четырех терминального зондирования, который использует различные пары тока и напряжения зондирования электродов, чтобы сделать более точные измерения. Существует несколько коммерчески доступных устройств для измерения трансепителиального неблагополучия, но, несмотря на простоту использования и высокую надежность, существуют также некоторые недостатки, такие как неотменяемая частота вывода и их дорогота.
Таким образом, мы представляем, как построить экономически эффективный и программируемый вольт-амметр. Сначала мы хотим показать, как работает измерение TEER с коммерчески доступными устройствами. Для этого мы обучат клеточный слой клеток эпителиальных клеток эпителиальной папилломы хороидного сплетения на фильтрах Transwell размером с три микрометра.
Эта настройка была описана Schroten et al. как в пробирке модель гемро-спинномозговой жидкости барьера. Электрод палочки соединен с эпителиальным вольт-амметром.
Устройство включено и настроено для измерения сопротивления. Электрод стерилизован в 80% этанола и впоследствии equilibrated в соответствующей среде. Измеримое значение будет служить эталонным значением для оценки надежности вольт-амметра, который будет собран впоследствии.
В этом примере мы записываем неприступляем 680 ом. Начнем со сборки малобюджетного вольт-амметра с программируемой частотой вывода. Прежде всего, вам понадобится стандартное зарядное устройство USB, и USB удлинитель, как пятивольтный прямой ток питания.
8-битный микроконтроллер на доске разработки USB будет использоваться для генерации квадратного волнового тока. Четыре кабеля с банановыми пробками соединены с двумя стандартными мультиметрами для измерения напряжения и тока. Пожалуйста, убедитесь, что мультиметры способны измерять ток в диапазоне некоторых микроамперов с TrueRMS.
На стандартных телефонных кабелях можно найти женский разъем RJ14. Просто убедитесь, что разъем имеет шесть контактов, из которых по крайней мере внутренние четыре подключены. Наконец, вам понадобится некоторое стандартное оборудование, как наши кабели, блеск терминала, 120 kiloohm резистор, а некоторые инструменты, как изоляция стриптизерш, обжимной инструмент, проволоки конце феррулы, и паяльник.
Устройство собрано точно так же, как показано на диаграмме макета. Во-первых, расширение USB подключено к микроконтроллеру. Во время нормальной работы, он питается от пятивольтного зарядного устройства USB DC, которые могут быть легко подключены к персональным компьютером для программирования.
Два кабеля раздели и обжимной с проволокой конца ferrules с одной стороны. Другая сторона припой либо непосредственно контактный ноль и два микроконтроллера или припой люки, которые, в свою очередь, обрезаются на соответствующие булавки. Далее кабели питания соединены с блеском терминала.
Первый мультиметр будет использоваться для измерения тока и соединен в ряд с резистором 120 килом и током-проходя электродами палочки. Этот механизм гарантирует, что ток вывода ограничен, поэтому измерение не будет иметь никакого влияния на жизнеспособность клеток. Четыре проводника шнура удлинителем телефона демонтируются и обжимаются до феррулей, как показано ранее.
Как только кабель будет подготовлен, вам придется проверить непрерывность проводников и булавок. В нашем примере штифт от трех до шести соединен с белым, коричневым, зеленым и желтым проводником. Теперь булавка пять и шесть, то есть зеленый и желтый, подключены к блеск терминала для применения напряжения к внешней паре электродов.
Наконец, вам придется подключить второй мультиметр, который будет использоваться для измерения падения трансепителиального напряжения, к булавкам три и четыре, то есть, в нашем примере, к белому и коричневому проводнику. Мы решили установить установку в дешевом пластиковом шасси. Перед первым использованием должен быть запрограммирован микроконтроллер.
Исходный код записан на C-код и может быть загружен с помощью USB. Короче говоря, контактный ноль в режиме вывода центра. При включении цикл функции начнет чередоваться в качестве контактов между землей и плюс пять вольт с переменной задержкой.
В нашем примере мы использовали теоретическое время полу колебаний в 40 миллисекунд. Давайте посмотрим, как результаты измерений соотносятся с эталонные значения, которые мы получили ранее. Электрод палочки перепозиционирован на недавно собранный вольт-амметр.
Устройство работает в три этапа. То есть подключить USB-зарядное устройство, переключить левый мультиметр на измерение напряжения переменного тока и переключить второй мультиметр на микроампер. Обратите внимание, что переменный ток должен быть выбран явно.
В этом примере потенциальное падение через систему фильтров Transwell измеряется примерно как 25 милливольт, в то время как мы записываем ток 37,1 микроамперов. В соответствии с Законом Ома, электрическое неуступчивое значение может быть легко рассчитано на уровне 674 ом, что очень близко к эталонной стоимости 680. Мы показали, что значения измерений являются надежными в диапазоне от нуля до 1,8 килохм.
Таким образом, описанный вольт-амметр можно использовать как для первоначальных экспериментов, так и для дальнейших исследований. Однако, если ваши результаты будут опубликованы, вы всегда можете поддержать ваши данные, путем измерения потока молекул через соответствующий слой клеток.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании представлен экономически эффективный метод измерения трансэпителиального электрического импеданса с использованием программируемого вольт-амперметра, разработанного для работы с электродами из палочек. Данный подход повышает доступность измерений сопротивления в эпителиальных монослоях, что имеет решающее значение для оценки барьерной функции в клеточных культурах.
Основные компоненты исследования
Область исследования
- Биология клетки
- Измерения электрического импеданса
- Оценка барьерной функции
Теоретические основы
- Измерение трансэпителиального электрического импеданса используется с 1980-х годов для оценки эпителиальных монослоев.
- Стандартные приборы для таких измерений могут быть дорогостоящими и не всегда обеспечивают возможность настройки рабочих частот.
- В данной работе представлена доступная альтернатива, обеспечивающая точность и надежность результатов.
Используемые методы
- Сборка вольт-амперметра с использованием стандартных электронных компонентов.
- Использование клеток эпителиальной папилломы сосудистого сплетения, культивируемых на фильтрах Transwell, в качестве модельной системы.
- Применение четырехконтактного метода измерения для повышения точности измерений.
Основные результаты
- Собранный вольтамперметр обеспечивал надежные показания импеданса, при этом измеренные значения тесно соответствовали эталонным значениям.
- Измерения электрического импеданса продемонстрировали диапазон достоверности от 0 до 1,8 килоом.
- Результаты измерений подтвердили пригодность устройства как для первичных экспериментов, так и для дальнейших исследований.
Выводы
- В данном исследовании представлено доступное и недорогое решение для проведения измерений электрического сопротивления в клеточных культурах.
- Полученные результаты имеют важное значение для совершенствования методов биологических исследований и оценки свойств клеточного слоя.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Экономически эффективные и программируемые решения для измерения TEER позволяют масштабно оценивать функцию эпителиального барьера, обеспечивая валидацию мишеней на ранних стадиях и снижение механистических рисков при поиске новых лекарственных средств. Предоставляя надежные количественные данные об импедансе, этот подход повышает прогностическую достоверность доклинических моделей гематоэнцефалического, гематоликворного, желудочно-кишечного и легочного барьеров. Данный метод способствует приоритизации портфеля препаратов за счет снижения биологической неопределенности в рабочих процессах идентификации ведущих соединений.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы посредством количественной оценки целостности барьера в клеточных моделях, релевантных для конкретных заболеваний.
- Практическая ценность: способствует функциональной валидации мишеней путем корреляции генетических или фармакологических воздействий с измеримыми изменениями трансэпителиального сопротивления.
- Прогностическая ценность: облегчает снижение механистических рисков, обеспечивая воспроизводимые, программно-задаваемые по частоте показатели импеданса, которые отражают формирование плотных контактов и жизнеспособность монослоя.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Обеспечивает стандартизированные количественные результаты для оценки влияния соединений на барьерную функцию в форматах, совместимых с высокопроизводительным скринингом.
- Практическая ценность: Обеспечивает воспроизводимость анализа за счет программируемой частоты выходного сигнала и четырехполюсника измерения, что минимизирует вариабельность измерений между сериями опытов.
- Масштабируемость: Позволяет повторно использовать платформу для различных клеточных линий и форматов Transwell благодаря недорогому и настраиваемому дизайну оборудования.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная непрерывность: обеспечивает связь между этапами фундаментальных исследований и доклинических испытаний, предоставляя релевантные для заболевания показатели барьерной функции, которые позволяют прогнозировать проницаемость in vivo и целостность тканей.
- Оптимизация рисков при разработке: способствует принятию решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) за счет раннего выявления соединений, нарушающих барьерную функцию на начальных этапах разработки.
- Соответствие биомаркерам: позволяет коррелировать изменения TEER с трансляционными биомаркерами состояния эпителия и модуляции плотных контактов.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод интегрируется в общий процесс разработки — от ранней валидации мишени и идентификации ведущих соединений до доклинической оценки преодоления барьера, что позволяет осуществлять прогресс на основе объективных данных о функциональной целостности эпителия.
- Открывающая биология: обеспечивает проверку гипотез и уточнение путей передачи сигналов путем установления связи между генетическими или фармакологическими воздействиями и измеряемыми изменениями импеданса эпителия.
- Скрининг: обеспечивает готовность анализа и количественные показатели импеданса, что позволяет проводить надежное сравнение условий тестирования для библиотек соединений.
- Аналитика: обеспечивает точные измерения сопротивления (в диапазоне 0–1.8 kΩ) и сигналы с программируемой частотой, что способствует статистическому сравнению и нормализации данных.
- Трансляционные исследования: обеспечивает преемственность с доклиническими исследованиями путем моделирования барьерных систем человека (например, кровяно-спинномозгового барьера) с использованием валидированных клеточных линий.
- Корпоративное повторное использование: представляет собой многократно используемую недорогую возможность оценки барьерной функции в рамках нескольких проектов и терапевтических областей.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает прогностическую уверенность при валидации мишеней за счет снижения неопределенности в понимании механизмов, связанных с барьерными функциями.
- Операционная ценность: Обеспечивает стандартизацию и воспроизводимость благодаря программируемому контролю частоты и четырехполюсной архитектуре измерения.
- Стратегическая ценность: Повышает эффективность использования капитала, позволяя собирать надежные системы TEER внутри организации, что снижает зависимость от дорогостоящих коммерческих устройств.
- Влияние на портфель: Помогает в приоритизации с учетом рисков, позволяя на ранних этапах выявлять факторы, нарушающие целостность барьера, что минимизирует риски потерь на поздних стадиях разработки.
Особенности реализации
- Требуются базовые знания в области электроники для сборки, включая пайку, обжимку и проверку целостности цепей изготовленных на заказ кабелей и разъемов.
- Необходимо наличие платы разработки USB, 8-битного микроконтроллера, стандартных мультиметров с функцией TrueRMS для измерения микроампер и резистора 120 kΩ для ограничения тока.
- Требуется межкомандная стандартизация подготовки электродов, уравновешивания среды и времени проведения измерений для обеспечения воспроизводимости результатов.
- Необходима адаптация методов позиционирования и стабилизации электродов с помощью палочек при применении к Transwell с разным размером пор или разной толщиной клеточного монослоя.
- Метод ограничен измерениями импеданса в диапазоне 0–1.8 kΩ; системы с более высоким сопротивлением могут потребовать корректировки ограничительного резистора или коэффициента усиления усилителя.
