Изготовление волноводов нулевого режима для одномолекулярной микроскопии высокой концентрации

Представленный здесь протокол наносферной литографии для изготовления волноводов с нулевым режимом является доступным, недорогим методом, не требующим каких-либо специализированных инструментов или оборудования. Этот метод будет полезен для биофизики одиночных молекул и позволит большему количеству исследователей проводить эксперименты с одиночными молекулами при биологически значимых концентрациях флуоресцентных реагентов. Чтобы создать чистую поверхность для испарительного осаждения коллоидных частиц, поместите оптические покровные стекла из боросиликатного стекла в рифленые вставки банки для окрашивания стекла Coplin.

Наполните банку для окрашивания достаточным количеством ацетона, чтобы покрыть покровные листы, и накройте банку. Обработайте банку ультразвуком в течение 10 минут при температуре 40 градусов Цельсия. Вылейте ацетон и трижды промойте покровные листы дистиллированной водой.

Повторив обработку ультразвуком и ацетоном, заполните банку достаточным количеством гидроксида калия, чтобы покрыть покровные стекла. Проработайте баночку ультразвуком еще раз, накрыв крышкой, в течение 20 минут при температуре 40 градусов Цельсия. Промойте покровные стекла дистиллированной водой шесть раз, затем обработайте их ультразвуком в этаноле в течение 10 минут при температуре 40 градусов Цельсия.

Промыв покровные стекла трижды дистиллированной водой, аккуратно подхватите каждый покров по краю с помощью щипцов. Высушите каждый покровный лист газообразным азотом и поместите каждый чистый сухой покровный лист и его собственную чашку Петри. Центрифуга 50 микрон нефункционализированных гранул полистирола размером в один микрон.

Выбросьте надосадочную жидкость, оставив как можно меньше оставшейся воды. Суспендируйте шарики в 50 микролитрах растворителя, затем тщательно перемешайте с помощью пипетирования. Чтобы настроить камеру влажности для осаждения, расположите в ряд шесть чашек Петри.

Поместите по одному покровному стеклу в каждую чашку Петри и оставьте крышки слегка приоткрытыми, а покровные стекла расположите так, чтобы они подвергались воздействию окружающей среды. Поместите гигрометр и небольшой электрический вентилятор в центр за чашками Петри, а затем запишите относительную влажность в лаборатории. Наполните стакан объемом 200 миллилитров от 150 до 200 миллилитров воды при температуре примерно 75 градусов Цельсия и поместите стакан за вентилятор.

Включите вентилятор и накройте чашки Петри, вентилятор, стакан и гигрометр перевернутым прозрачным пластиковым контейнером для хранения. Когда относительная влажность воздуха достигнет 70-75%, слегка приподнимите пластиковый контейнер для хранения и быстро закройте крышки чашек Петри, чтобы предотвратить переувлажнение покровных стекол. Когда относительная влажность воздуха в камере достигнет 85%, пипетку нанесите пять микролитров шарика на центр каждого покровного стекла.

Накройте каждую чашку Петри сразу после осаждения и держите все накрытым в контейнере для хранения между отложениями. Осаждение валиков должно быть завершено как можно быстрее, чтобы свести к минимуму потерю влаги. Если осаждение слишком сухое или влажное, наиболее важной переменной для оптимизации является влажность камеры.

Когда все шесть осадков будут завершены, запишите относительную влажность в камере и дайте каплям растечься и высохнуть в течение пяти минут. Чтобы обеспечить равномерную температуру поверхности для отжига полистирольных шариков, поместите плоскую фрезерованную алюминиевую пластину поверх стандартной керамической нагревательной пластины и установите температуру горячей пластины на уровне 107 градусов Цельсия, что соответствует температуре стеклования полистирола. Поместите покровную крышку, содержащую шаблон для валика, на горячую алюминиевую пластину.

После отжига в течение 20 секунд снимите покровное стекло с алюминиевой пластины и сразу же поместите его на алюминиевую поверхность комнатной температуры для охлаждения. Используя термическое испарительное осаждение, нанесите 300 нанометров меди со скоростью два ангстрема в секунду на покровные стекла, содержащие шаблоны валиков. Это создаст столбы в промежутках между бусинами.

Чтобы удалить излишки меди с шариков, аккуратно прижмите кусочек ленты к поверхности, а затем медленно снимите ленту. Растворите полистирольные шарики, поместив покровные стекла в толеун и оставив их на ночь. Осторожно обращаясь с чехлом, промойте их один раз хлороформом и два раза этанолом.

Подсушите шаблоны азотом. Поместите их в кислородный плазменный очиститель на 30 минут, чтобы удалить остатки полимера и загрязнений. Используя термическое испарительное осаждение, нанесите три нанометра слоя адгезии титана со скоростью один ангстрем в секунду, а затем нанесите от 100 до 150 нанометров алюминия со скоростью четыре ангстрема в секунду вокруг и поверх медных столбов.

Убедитесь, что образцы не вращаются во время осаждения, как это автоматически делается в некоторых установках для осаждения. Чтобы растворить медные штифты, замочите покровные стекла в медном травлении на два часа. Промыв покровные стекла в дистиллированной воде, высушите их азотом, затем аккуратно отполируйте поверхность линзовой бумагой, чтобы обнажить все столбы, которые все еще покрыты облицовкой.

Замочите покровные стекла в медном травлении еще на два часа, затем снова промойте их дистиллированной водой и высушите азотом. После пассивации поверхности волноводные покровные стекла нулевого режима могут быть соединены с кварцевыми стеклами с помощью двусторонней липкой ленты для создания микрофлюидных проточных камер для визуализации одиночных молекул. Успех самостоятельной сборки коллоидного шаблона критически зависит от относительной влажности воздуха.

В правильно сформированном шаблоне область бусин круглая с границами, определенными непрозрачным многослойным кольцом. В правильно сформированных шаблонах большинство шаблонов должны содержать шестиугольно плотно упакованные бусины. Между зернами будут некоторые дефекты из-за заклинивания во время испарительного осаждения.

После осаждения меди и растворения гранул полистирола медные столбы должны быть менее 150 нанометров в диаметре. Для глубины осаждения меди на глубине 300 нанометров высота столбов составляет около 250 нанометров. После осаждения алюминиевой оболочки и последующего растворения медных столбов волноводы должны быть видны с помощью атомно-силовой микроскопии и находиться на расстоянии около 550 нанометров друг от друга.

Отжиг полистирольных шаблонов в течение 20 секунд позволил получить алюминиевые волноводы диаметром 118 нанометров, достаточно малые, чтобы перекрыть распространение видимого света. Типичное поле ZMW для визуализации содержит 3000 волноводов в поле зрения 40 на 80 микрон. Для тестирования функциональности ZMW был проведен одномолекулярный FRET.

Следы FRET на одной молекуле были обнаружены при всех концентрациях флуорфора Cy5 в окружающей среде. Для сравнения, одиночные молекулы могут быть обнаружены только при освещении TERF с пикомолярными или низкими наномолярными концентрациями. После изготовления волноводов с нулевым режимом устройства могут быть пассивированы полимерами для уменьшения неспецифических взаимодействий во время визуализации отдельных молекул

Стеклянные днища волноводов нулевой моды также могут быть слегка протравлены для усиления излучения одиночных молекул. В целом, этот новый метод изготовления волноводов с нулевым режимом позволит исследователям легче исследовать динамические биохимические процессы, такие как транскрипция или трансляция в концентрациях и скоростях, близких к тем, которые находятся в клетке.