Высокопроходимых Всего внутреннего отражения флуоресценции и прямой стохастической оптической реконструкции микроскопии с помощью фотонического чипа
November 16th, 2019
Оптическая микроскопия на основе микросхем на основе суперразрешения является новым подходом к флуоресценции и предлагает преимущества в экономической эффективности и пропускной способности. Здесь показаны протоколы подготовки и визуализации чипов для микроскопии TIRF и микроскопии на основе локализации суперразрешения.
Основной целью этой рукописи является представление процедуры визуализации недавно разработанной фотонной микроскопии TIRF на основе чипов и микроскопии локализации одной молекулы, такой как dSTORM. Основным компонентом здесь является фотонический чип, которые сделаны из серии оптических волновых гидов. Свет внутри оптического волнового гида направлен на основе полного внутреннего отражения.
Часть света присутствует на поверхности в виде эвакуационых волн. Эти evanescent волны, они распадаются экспоненциально от поверхности, с глубиной проникновения в пару сотен нанометров. Это делает их пригодными для освещения TIRF.
Освещение TIRF с помощью оптического волнового гида доступно на очень большой площади, которая определяется геометрией волнового гида и, таким образом, идеально подходит для изображений с высокой пропускной способностью. Ключевое различие между традиционной установкой TIRF и dSTORM по сравнению с нашим подходом заключается в том, что мы используем фотонический чип для освещения образца, вместо того, чтобы посылать свет через объектив с целью визуализации. Наш подход отъединяет освещение и световую часть коллекции, открывая новые возможности визуализации.
Поместите чип в стеклянную чашку Петри с помощью вафельного пинцета и полностью накройте раствором 1%Hellmanex. Поместите чашку Петри на горячую плиту при 70 градусах в течение 10 минут. Пока все еще на hotplate, протрите поверхность с тампоном ткани cleanroom.
Удалите чип из чашки Петри. Промыть не менее 100 миллилитров деионеров воды. Промыть по крайней мере 100 миллилитров изопропанола, заботясь о том, чтобы растворитель не высыхает на поверхности, чтобы предотвратить испарение пятен.
Промыть не менее 100 миллилитров деионеров воды. Удар чип сухой с азотной пушкой. Приготовьте более поздние 150 микрометров PDMS, вращая его в чашке Петри.
Используйте скальпель, чтобы вырезать примерно 1,5 на 1,5 сантиметра кадра из слоя PDMS. Поднимите раму из чашки Петри пинцетом. Депозит его плашмя на чистый и полированный чип.
Образец теперь готов для посева клеток. После посева клеток удалите чип из мультимедиа. Используйте пипетку, чтобы удалить излишки жидкости из-за пределов камеры PDMS.
Удалите текущую жидкость из камеры PDMS с помощью пипетки, добавляя при этом около 60 микролитров чистого PBS одновременно. Заменить PBS с 60 микролитров чистой PBS, и пусть инкубировать в течение одной минуты. Повторите предыдущий шаг, позволяя ему инкубировать в течение пяти минут на этот раз.
Удалите PBS и замените его 60 микролитров раствора красителя. Оставьте образец инкубировать в течение 15 минут, защищая его от света. Вымойте образец с помощью PBS с помощью ранее описанной процедуры.
Удалите PBS и замените его 40 микролитров буфера изображения одновременно. Поместите крышку сверху, предотвращая образование пузырьков воздуха под ним. Аккуратно нажмите крышку на камеру визуализации, чтобы удалить излишки мультимедиа.
Используйте пипетки, чтобы удалить излишки мультимедиа за пределами крышки. Очистите область за пределами крышки с водой влажный тампон, чтобы избежать кристаллов, образованных сушеных остатков средств погружения. Эта версия установки состоит из трех основных компонентов.
Микроскоп с держатель фильтра, белый источник света, камера, и объективный револьвер. Этап соединения, который является трехосной стадией пьезо, с лазером, со волокном, и сотый объектив. Образец этап, который является одной оси ручной этап, с кончиком и наклоном, с вакуумным держателем.
Как соединение, так и этап выборки устанавливаются на двухосной моторизованной сцене для выборочных переводов. Поместите чип на вакуумный грузовик, с аспектом соединения к цели соединения. Убедитесь, что чип находится примерно на одном фокусном от цели соединения.
Включите вакуумный насос. Включите лазер до одного милливатта. Грубо отрегулируйте высоту чипа так, чтобы луч попал в его край.
Выключите лазер. Включите белый источник света. Выберите объектив с низким увеличением объектива, например, 10x.
Сосредоточьте микроскоп на волновой гиде. Переведить микроскоп вдоль волнового гида, чтобы увидеть, хорошо ли он выровнен с оптическим путем. Перемести микроскоп к краю соединения.
Включите лазер на один милливатт или меньше. Перевейте микроскоп вдоль края соединения, чтобы найти лазерный свет. Сосредоточьте луч на краю чипа.
Отрегулируйте этап соединения вдоль оптического пути в направлении, которое уменьшает размер пятна лазерного луча до тех пор, пока оно не исчезнет. Луч теперь находится выше или ниже поверхности чипа. Отрегулируйте высоту стадии соединения до тех пор, пока пятно луча не появится и не будет максимально.
Повторите два предыдущих шага, пока лазер не образует сфокусированное пятно. Перемести сфокусированное место в волновой гид, представляющий интерес. Перевестив микроскоп на небольшое расстояние от края так, чтобы сфокусированное пятно луча больше не было видно.
Выключите белый свет. Отрегулируйте контраст. Если волновой гид направляет, рассеянный свет вдоль волнового гида должен быть хорошо виден.
Отрегулируйте ось стадии соединения, чтобы максимизировать рассеянную интенсивность света. Выключите лазер. Включите белый свет.
При необходимости отрегулируйте контраст. Перейдите в область визуализации. Сосредоточьтесь на желаемой цели.
Выключите белый свет. Вставьте фильтр флуоресценции и поверните мощность лазера до одного милливатта. Установите время экспозиции камеры примерно до 100 миллисекунд.
Отрегулируйте контраст по мере необходимости. Убедитесь, что соединение по-прежнему оптимизировано. Найдите область, интересную для визуализации.
Включите этап пьезо, зацикленный на средних узлах. Захват по крайней мере 300 изображений. Загрузите захваченный стек изображений на Фиджи с помощью виртуального стека.
Из меню изображений на Фиджи выберите Stacks и Проект. Рассчитайте изображение TIRF, выбрав тип проекции, среднюю интенсивность. Включите лазер до одного милливатта и установите время экспозиции камеры до 30 миллисекунд.
Отрегулируйте контрастность и фокусировку. Увеличьте мощность лазера до тех пор, пока не будет наблюдаться мигание. Увеличьте масштаб небольшой области выборки.
Отрегулируйте контраст. Захват несколько изображений, чтобы увидеть, если мигает хорошо разделены. Отрегулируйте время экспозиции камеры для оптимального мигания.
Включите петель сцены пьезо. Запись стека изображения, по крайней мере 30000 кадров, в зависимости от плотности мигания. Откройте Фиджи и загрузите стек dSTORM в качестве виртуальных изображений.
При необходимости отрегулируйте контраст. Используйте прямоугольный инструмент, чтобы выбрать область, которую вы хотите реконструировать. Анализ Open Run в плагине ThunderSTORM на Фиджи.
Установите основные настройки камеры в ThunderSTORM, соответствующие вашему устройству. Остальные параметры по умолчанию, как правило, являются удовлетворительными. Начните реконструкцию.
Список локализации, предоставляемый программным обеспечением реконструкции, фильтруется для удаления неспецифических локализаций. При необходимости применяется дополнительная коррекция дрейфа. Основное различие между чип-изображения и традиционной визуализации в приборов и сбора данных.
Таким образом, качество реконструированных изображений можно оценить так же, как изображение из коммерческого микроскопа супер-разрешения. Поскольку используются многомодальные волновые моды, полученное изображение может, однако, проявлять неоднородное возбуждение, если собрано слишком мало изображений. Это показано на панели А.
Увеличение количества возбудимых моделей должно привести к неоднородной возбуждению, как показано на панели b. Здесь мы изображение печени синусоидальной эндотелиальной клетки, с флуоресцентно помечены плазменной мембраны. Панели a и b являются изображениями с ограниченной дифракцией.
Панель c показывает ограниченное дифракцией изображение вставки в панели b. Панель d показывает dSTORM изображение того же региона. Синусоидальные эндотелиальные клетки печени имеют фенестрацию размером с нано в плазменной мембране, которые хорошо видны на изображении супер-разрешения в панели d.
Одним из главных преимуществ изображения на основе чипов на основе супер-разрешения является достижимое большое поле зрения. Панель показывает 500 микрон на 500 микрон-большой dSTORM изображение печени синусоидальных эндотелиальных клеток с флуоресцентно помечены микротубулин. Панель b показывает пурпурную вставку из панели A, с изображениями с ограниченным дифракцией и супер-разрешением для сравнения.
Панель c показывает зеленую вставку с панели a. Разрешение захваченного изображения составляет 77 нанометров. В этом видео, мы выполнили большое поле зрения TIRF и dSTORM изображения синусоидальных эндотелиальных клеток печени с помощью фотонной чип для освещения.
Наш метод менее сложен, компактнее и гибче обычного способа выполнения TIRF с помощью микроскопа с целью предопределенной численной диафрагмы и низкого поля зрения. Микроскопия локализации, такая как dSTORM, является одним из нескольких методов визуализации супер-разрешения, которые мы исследовали с помощью фотонной чипа. Например, свет может быть гораздо более плотно ограничен внутри высокорефракционного индекса оптического волнового материала, чем это возможно с помощью объектива, объективного изображения.
Это свойство чипового освещения нашло применение в увеличении разрешения метода оптической микроскопии на основе интенсивности и структурированной микроскопии освещения. Кроме того, фотонический чип также выигрывает от миниатюризации, эффективности затрат и простой оптической установки. Будучи интегрированной технологией делает его совместимым с другими оптическими функциями на чипе.
В целом, это позволяет переоборудовать в обычные микроскопы с ограниченной дифракцией, что позволяет супер-разрешение при низких затратах.
Обзор
В данной статье представлена новая техника суперразрешающей оптической микроскопии на основе чипов, сосредоточенная на микроскопии TIRF и микроскопии локализации одиночных молекул. Подробно описан протоколы подготовки чипов и получения изображений, подчеркивая преимущества данного подхода в плане экономической эффективности и производительности.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Флуоресцентная микроскопия
- Суперразрешающая визуализация
- Фотонная чип-технология
Предпосылки
- Традиционная микроскопия TIRF основывается на освещении объективной линзой.
- Фотонные чипы используют оптические волноводы для направления света.
- Эванесцентные волны обеспечивают высокоразрешающую визуализацию на уровне поверхности.
- Этот метод увеличивает область и производительность визуализации.
Цель исследования
- Продемонстрировать новый метод визуализации с использованием микроскопии TIRF на основе фотонного чипа.
- Сравнить традиционные методы с подходом на основе чипа.
- Предоставить подробные протоколы по подготовке чипов и получению изображений.
Использованные методы
- Подготовка фотонных чипов с использованием оптических волноводов.
- Протоколы посева клеток и инкубации для подготовки образцов.
- Установка для визуализации, включающая микроскоп, лазер и камеру.
- Захват и обработка изображений с использованием программного обеспечения Fiji.
Основные результаты
- Успешная демонстрация возможностей высокопроизводительной визуализации.
- Ясное наблюдение рассеянного света вдоль волновода.
- Эффективная локализация одиночных молекул с использованием новой установки.
- Повышенная разрешающая способность изображений по сравнению с традиционными методами.
Выводы
- Подход на основе чипа предлагает значительные преимущества в флуоресцентной микроскопии.
- Разделение освещенности и сбора информации улучшает возможности визуализации.
- Этот метод открывает путь для будущих достижений в области суперразрешающей микроскопии.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Chip-based nanoscopy decouples excitation and collection pathways, enabling large field-of-view TIRF imaging with low magnification optics. This approach supports high-throughput super-resolution imaging while maintaining resolution comparable to traditional methods, addressing discovery-stage bottlenecks in target validation and phenotypic screening. The technique enhances predictive confidence by providing quantitative, reproducible subcellular imaging data across scalable sample areas.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of subcellular structures like liver sinusoidal endothelial cell fenestrations and plasma membrane organization at 76 nm resolution.
- Operational Value: Decoupled illumination and collection allow use of low magnification lenses, increasing field of view for population-level target engagement analysis.
- Predictive Value: Large-area dSTORM imaging supports statistical robustness in target localization and heterogeneity assessment.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Uniform evanescent wave excitation across waveguide-defined areas enables consistent single-molecule localization for assay readouts.
- Operational Value: Compatibility with standard microscopes and on-chip integration supports assay standardization and reuse across discovery campaigns.
- Scalability: Demonstrated 500 µm x 500 µm imaging area enables multiplexed condition testing in a single acquisition.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Disease-relevant LSEC imaging validates applicability to endothelial pathophysiology models.
- Mechanistic De-risking: Super-resolution visualization of nano-scale membrane features aids in understanding drug-target spatial relationships.
- Preclinical Alignment: Resolution and throughput support biomarker localization studies in primary or stem-cell-derived systems.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to lead identification workflows, providing super-resolution readouts that inform target confidence and assay reproducibility prior to compound screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing via direct visualization of target localization and clustering in native membrane environments.
- Screening: Enables assay readiness through quantifiable, high-density localization data from large sample regions.
- Analytics: Generates filtered localization lists and drift-corrected reconstructions for objective comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical validation through imaging of disease-relevant cellular ultrastructure in primary cell models.
- Enterprise Reuse: Photonic chip infrastructure can be retained across projects, reducing retooling costs for super-resolution capable imaging.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through nanoscale resolution of membrane protein organization and dynamics.
- Operational Value: Standardized chip preparation and imaging protocol ensures reproducibility across users and sites.
- Strategic Value: Enables go/no-go decisions based on subcellular target distribution data, reducing late-stage attrition from mechanistic misunderstanding.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of targets supported by super-resolution spatial evidence in relevant cellular contexts.
Implementation Considerations
- Expertise in photonic chip handling, fluorescence microscopy, and single-molecule localization analysis required.
- Instrumentation includes laser source, piezo stage, vacuum holder, and fluorescence filter set compatible with TIRF and dSTORM.
- Cross-team standardization needs include chip cleaning procedures, PDMS chamber fabrication, and Fiji/ThunderSTORM analysis pipelines.
- Adaptation considerations involve optimizing excitation patterns for homogeneous illumination across different waveguide geometries and sample types.
- Practical limitations include potential inhomogeneous excitation with insufficient pattern averaging and minor resolution trade-off versus high-NA objective TIRF.
