Выделение и обогащение эпителиальных клеток-предшественников легких человека для органоидной культуры

3D-культуры органоидов находятся проксимальнее в дистальном эпителии легких, разработанном с использованием этого протокола. Предоставление податливой модели для изучения фундаментальных механизмов поддержания легочной ткани или ремоделирования, связанного с заболеванием, и служит эффективной платформой для открытия и валидации лекарств. Этот протокол совместим с другими подходами к клеточному фракционированию диссоциации тканей.

А поскольку эпителиальные клетки-предшественники, выделенные из разных анатомических компартментов, сохраняют свою позиционную идентичность in vitro, их можно использовать для моделирования региональных различий в реакциях легких на экзогенные или эндогенные стимулы. Этот метод может быть использован для выделения различных субпопуляций эпителиальных клеток, включая регионоспецифичные клетки-предшественники, которые могут быть культивированы для получения специализированного дифференцированного потомства, представляющего регион происхождения. При поступлении легочной ткани отделите проксимальные отделы трахеи и бронхов от дистального эпителия легких, который содержит небольшие дыхательные пути диаметром два миллиметра или меньше, и окружающей паренхиматозной ткани.

Поместите образцы в индивидуальные стерильные чашки Петри размером 150 на 15 миллиметров и нарежьте дистальный образец ткани кубиками примерно по одному сантиметру. Поместите кусочки в чистую 50-миллиметровую трубку и трижды промойте салфетки свежим охлажденным HBSS за одну стирку. После последней стирки переложите салфетки в новую чашку Петри и промокните кусочки насухо стерильными салфетками против ворса.

Затем с помощью щипцов и ножниц удалите как можно больше висцеральной плевры, прежде чем измельчить ткани на фрагменты диаметром примерно два миллиметра. Для расщепления фрагментов тканей добавьте 50 микрограммов на миллилитр либеразы и 25 микрограммов на миллилитр ДНК в 25 миллилитрах стерильного HBSS в конической пробирке объемом 50 миллилитров. И добавляем в трубочку примерно два-три грамма измельченной ткани.

Затем поместите салфетки при температуре 37 градусов Цельсия с непрерывным встряхиванием со скоростью 900 оборотов в минуту в течение 40-60 минут. Через 30 минут используйте шприц объемом 10 миллилитров, чтобы растирать переваренную ткань, чтобы предотвратить образование комков. В конце инкубации используйте шприц объемом 10 миллилитров, оснащенный иглой 16 калибра, чтобы растирать ткань пять раз.

Затем с помощью пипетки с широким отверстием пропустите суспензию через ряд сетчатых фильтров под давлением вакуума, как указано. После промывки последнего фильтра 20 миллилитрами HBSS plus для сбора оставшихся клеток, центрифугируйте фильтраты для сбора выделенных клеток. После удаления надосадочной жидкости добавьте в гранулы один миллилитр буфера для лизиса эритроцитов с помощью щадящего пипетирования перед инкубацией клеток в течение одной минуты со льдом.

В конце инкубации добавьте от 10 до 20 миллилитров HBSS плюс буфер для нейтрализации лизиса и соберите оставшиеся клетки путем центрифугирования. Истощайте CD31-положительные эндотелиальные клетки и CD45-положительные иммунные клетки из пула общих клеток с помощью микрогранул CD31 и CD45, конъюгированных с моноклональными антителами против человека CD31 и CD45 и колонками LS в соответствии с протоколом производителей. Для окрашивания поверхности клеток для FACS добавьте соответствующие первичные антитела, представляющие интерес, в требуемой концентрации и инкубируйте клетки в течение 30 минут при температуре 4 градуса Цельсия в темноте.

В конце инкубации промойте клетки тремя миллилитрами HBSS плюс и пометьте клетки соответствующей концентрацией флуорофорного конъюгированного вторичного антитела в течение 30-минутной инкубации на льду, в зависимости от ситуации. В конце инкубации промойте клетки тремя миллилитрами HBSS плюс и повторно суспендируйте клетки в соотношении от 10 до 7 клеток на миллилитр концентрации HBSS плюс перед фильтрацией клеток в пятимиллилитровые полистирольные пробирки через крышку фильтра, чтобы обеспечить образование одноклеточной суспензии. Затем добавьте один микрограмм на миллилитр DAPI, чтобы окрашивать проницаемые клетки.

Для обогащения проксимальных тканевых эпителиальных клеток-предшественников отделите проксимальные дыхательные пути от легких и с помощью ножниц откройте дыхательные пути по всей длине, чтобы обнажить просвет. Покройте ткани в 50 мкг на миллилитр либеразы в течение 20-минутной инкубации при 37 градусах Цельсия при непрерывном встряхивании на миксере. В конце инкубации перенесите ткань в стерильную чашку размером 150 на 15 миллиметров и с помощью скальпеля аккуратно соскребите поверхность дыхательных путей, чтобы полностью отделить клетки люминального эпителия от ткани.

Затем вымойте чашку пятью миллилитрами стерильного буфера HBSS plus, чтобы собрать все смещенные клетки люминального эпителия, и перенесите клетки в 50-миллилитровую коническую центрифужную пробирку. Последовательно растирайте суспензию пять раз с помощью пипетки объемом 10 миллилитров, чтобы получить одноклеточную суспензию. Затем соберите суспензию методом центрифугирования.

Затем повторно суспендируйте гранулу в свежем HBSS плюс буфер на льду. С помощью ножниц разрежьте оставшуюся трахеобронхиальную ткань вдоль ее колец для получения небольших полосок ткани. В новой посуде используйте одностороннее лезвие бритвы, чтобы измельчить полоски на более мелкие кусочки и перенести кусочки ткани в С-образные трубки, содержащие два миллилитра либеразы на трубку.

Затем используйте второй протокол легких человека на автоматическом диссоциаторе gentleMACS для дальнейшей механической диссоциации ткани. В конце диссоциации перенесите примерно два грамма измельченной проксимальной ткани в 50 миллилитровые конические трубки, содержащие 50 микрограммов на миллилитр либеразы и 25 микрограммов на миллилитр раствора ДНК. В конце 45-минутной инкубации при 37 градусах Цельсия с встряхиванием отфильтруйте тканевую суспензию через ряд ситечков, как показано для дистального отдела легочной ткани, и добавьте равный объем HBSS плюс буфер к фильтрату для остановки пищеварения.

Добавьте в пробирку изолированные клетки просвета проксимальных дыхательных путей и соберите клетки с помощью центрифугирования. Затем клетки могут быть обогащены путем выделения микрогранул и окрашены для маркеров клеточной поверхности, представляющих интерес, как это показано для дистальных клеток легочной ткани. Проксимальные дыхательные пути, выстланные псевдостратифицированным эпителием, содержат большое количество базальных клеток-предшественников, которые являются иммунореактивными для мембранного белка NGFR.

Напротив, эпителиальные клетки, выстилающие альвеолы, включают подмножество, которое демонстрирует иммунореактивность апикальной мембраны с моноклональным антителом HTII-280, что указывает на их альвеолярную идентичность клеток II типа. Истощение магнитными шариками загрязняющих эритроцитных, иммунных и эндотелиальных клеток приводит к значительному обогащению популяций эпителиальных клеток как в дистальных, так и в проксимальных образцах тканей с соответствующим повышением эффективности FACS. Дальнейшее истощение FACS приводит к образованию высокообогащенных дистальных клеточных популяций, которые могут быть дополнительно фракционированы на основе их поверхностного окрашивания NGFR или HTII-280.

Культуры эпителиальных клеток дистального отдела легких HTII-280 позволяют получать быстро растущие органоиды со средней эффективностью колониеобразования 10%Иммунофлуоресцентное окрашивание культур на 30-й день показывает, что просветные органоиды состоят преимущественно из HTII-280 и SPC-положительных дистальных эпителиальных клеток легких. Эпителиальные органоиды проксимального отдела легких, культивируемые из NGFR-положительных клеток, приводят к образованию просветных органоидов на 30-е сутки культивирования со средней эффективностью колониеобразования 7,8%Эмпирическая оптимизация ассоциации ферментативных тканей имеет решающее значение для сохранения поверхностных эпитопов, что позволяет иммунофлуоресцентное окрашивание и обогащение субпопуляций жизнеспособных эпителиальных клеток для последующего поколения регионально-специфичных организованных культур. Этот метод может быть адаптирован для идентификации и обогащения субпопуляций иммунных, сосудистых, стромальных и эпителиальных клеток, а также для разработки моделей совместного культивирования с использованием 3D-платформ органоидных чипов.

Недавно мы описали использование альвеолярных органоидов, полученных с помощью этого метода, в качестве платформы для изучения инфекции SARS-CoV-2 эпителия легких человека и для валидации лекарств от COVID-19.