Вывод белковых кристаллов с I3C с помощью случайного скрининга матрицы микросея
16 января 2021 г.
В этой статье представлен метод генерации кристаллов белка, полученных с помощью I3C (5-амино-2,4,6-трийодоизофталеновой кислоты) с использованием микросея, чтобы генерировать новые условия кристаллизации в редких матричных экранах. Лотки могут быть настроены с помощью жидких роботов дозирования или вручную.
Это протокол кристаллизации, предназначенный для оптимизации роста белкового кристалла при одновременном выводе белка с помощью поэтапной молекулы для определения структуры белка с помощью рентгеновской кристаллографии. Для определения рентгеновской кристаллической структуры совершенно нового белка условия кристаллизации оптимизированы для получения качественных кристаллов. В случае совершенно нового белка, тяжелые атомы должны быть введены в кристалл для производства производных кристалла.
Рентгеновские данные дифракции собираются из производных кристаллов и должны быть вычислительно решены для получения рентгеновской кристаллической структуры. Кристаллизация и производные являются трудоемкими процессами. Для устранения этих узких мест мы разработали оптимизированную процедуру скрининга, которая одновременно достигает обеих этих целей.
В этом протоколе используется ранее разработанный метод, известный как случайный микросеяный матричный скрининг. Кристаллы или кристаллические осадки измельчаются на микросея, которые могут быть использованы для начала роста кристалла в совершенно независимых условиях. В то же время мы вводим в состояние кристаллизации молекулу, называемую I3C.
Эта молекула обеспечивает большой аномальный сигнал, который позволяет структуре быть решена одной длины волны аномальной фазы обсуждения. Для пользователей, незнакомых с экспериментальным размером кристаллических структур, мы представляем удобный программный конвейер для частичной автоматизации структурного решения, адаптируя его к использованию аномального сигнала от I3C. Первым шагом является создание акций I3C.
Измерьте 120 миллиграммов I3C в трубку микроцентрифуга. Добавьте 200 микролитров двух молярных гидроксида лития в микроцентрифугную трубку. Отопление трубки при 40 до 60 градусов и вихри могут быть использованы для поощрять растворение.
Один молярный запас литиевого раствора I3C должен быть коричневым. Два метода могут быть использованы для введения I3C в белковый запас. Литий I3C может быть добавлен непосредственно в белковый запас.
3,75 микролитров до 30 микролитров I3C можно добавить в 150 микролитров белка, чтобы дать концентрацию от 5 до 14 миллимоляров. Некоторые белки могут осаждать при контакте с высокой концентрацией I3C. В этих случаях литий I3C может быть добавлен в буфер разбавления белка, который буфер соответствует образца белка в конечной концентрации от 10 до 80 миллимолей.
Добавьте 150 микролитров буфера разбавления белка в 150 микролитров образца белка. Стеклянный зонд для раздавить кристаллы изготовлен из стеклянной пипетки Пастера. С горелки Bunsen на синем пламени, тепло Пастер пипетки к середине.
Используя пару пинцетов, вытяните концы пипетки Pasteur в тонкий диаметр менее 0,3 миллиметра. Держите этот сегмент в пламени, чтобы отделить пипетки в этой точке и вокруг конца пипетки, чтобы закончить стеклянный зонд. Это пример того, как должна выглядеть стеклянная пипетка.
Кристалл давит также может быть заказан у сторонних поставщиков в качестве альтернативы сделать свой собственный запас микросея генерируется путем дробления кристаллов белка или кристаллических осадков. Поместите на лед пять микроцентрифуговых труб 1,5 мл. Под световым микроскопом выберите лучшие кристаллы морфологии или кристаллические осадки, которые могут быть принесены в жертву.
Для 96 хорошо кристаллизации лотки открыть хорошо, разрезая пластиковую уплотнительную ленту. Для висячих лотков капли, крышка скольжения могут быть удалены с помощью пинцета и перевернутый на плоскую поверхность. Перенесите 70 микролитров раствора резервуара в одну из микроцентрифуговых трубок и охладите на льду.
К оставшимся трубам перенесите 90 микролитров резервуарного раствора к нему и вернитесь в лед, чтобы охладиться. При недостаточном объеме резервуара присутствует кристаллизация резервуара может быть сделано путем смешивания соответствующих реагентов и может быть использован вместо. Агитировать кристаллы в кристаллизации падение с помощью стеклянного зонда тщательно раздавить его.
Прогресс можно контролировать под микроскопом до тех пор, пока не будут видны кристаллы или кристаллический материал. Перенесите всю жидкость из капли в микроцентрифуговую трубку, содержащую 70 микролитров раствора резервуара. Смешайте по трубе вверх и вниз.
Передача двух-трех микролитров смеси обратно в колодец и промыть колодец, трубя вверх и вниз. Перенесите смесь обратно в трубку микроцентрифуга. Этот шаг полоскания должен быть повторен еще раз.
Микроцентрифуг трубка должна быть холодной с этого момента вперед, чтобы избежать таяния микросея. Vortex трубки на максимальной скорости в четыре градуса в течение примерно трех минут охлаждения трубки на льду регулярно, чтобы предотвратить перегрев. сделать один из 10 серийных разбавления семенного фонда путем последовательной передачи 10 микролитров между охлажденными растворами резервуара.
Между разбавлениями семенного запаса трубка должна быть вихрем. Семена запасов, которые не будут немедленно использоваться, должны храниться в минус 80 градусов ультра холодной морозильной камере. 96 хорошо случайных микросея матричный экран может быть настроен с помощью жидкости дозирования робота.
Поместите семенной запас, раствор белкового бульона, дополненный I3C и экраном кристаллизации в роботе. С помощью робота перенесите 75 микролитров с экрана кристаллизации на лоток 96. Добавьте один микролитер к падению кристаллизации и 74 микролитров к резервуару.
Перенесите один микролитер белка, дополненный I3C, в каплю кристаллизации. Передача 0,1 микролитров семенного фонда в кристаллизацию капли. Печать пластины с помощью герметизации ленты.
Висячие экраны падения могут быть настроены в 24 хорошо висит капля кристаллизации лотки. Смазать края висячих колодцев падения. Перенесите в водохранилище 500 микролитров раствора кристаллизации.
Рядом с центром стеклянной крышки слайд место один микролитер капли кристаллизации раствора. К этой капле добавьте один микролитер белка, дополненный литиевым I3C и 0,1 микролитров семенного запаса. Инвертировать крышку слайда и печать кристаллизации хорошо, нажав крышку слайд в жир.
Висячие капли и уплотнения капли лотки инкубируются при постоянной температуре, чтобы кристаллы форме. Они должны регулярно проверяться под микроскопом для роста кристалла. После того, как данные дифракции были получены, интегрированы и масштабированы, как это объясняется в сопроводиваемом письменном протоколе, автоматизированный конвейер определения кристаллической структуры Auto-Rickshaw может быть использован для решения фазовой проблемы и моделирования белка.
На посадочной странице Auto-Rickshaw нажмите кнопку «Продолжить работу». Введите свой институциональный адрес электронной почты в веб-форме Auto-Rickshaw и нажмите продолжить работу Auto-Rickshaw. Для белков без гомологии мотошафом запустите протокол SAD Auto-rickshaw в продвинутом режиме.
Введите необходимые параметры. Выберите белок в качестве типа молекулы. Введите длину волны сбора данных в ангстремах.
Так как я, как элемент подструктуры, чтобы указать атомы йода были использованы. Выберите тип подструктуры I3C, чтобы указать, что I3C является фазированной молекулой. Выберите sub_direct в качестве метода определения подструктуры.
Выберите три в качестве числа ожидаемых подструктур на мономер. Введите один в качестве отсечения резервирования поиска подструктуры. Это позволяет Auto-rickshaw автоматически определить подходящее разрешение отсечения.
Введите количество остатков в одном мономере, космическую группу набора данных и количество молекул в асимметричном блоке на основе коэффициента Мэтьюса. Выберите соответствующий уровень распространения рентгеновских данных, который соответствует вашим потребностям. Вввещаем аномальные данные в пустой набор файлов.
Ввести белковую последовательность в качестве файла SE, PIR или TXT. Введите свой институциональный адрес электронной почты. Результаты доставляются вам по веб-ссылке, отправленной на предоставленный адрес электронной почты.
Если Auto-rickshaw не сможет решить структуру с помощью своей решительной подструктуры проверки подструктуры может помочь в устранении неполадок структуры решения. Скачать список тяжелых атомов сайтов из Auto-Рикша результаты страницы. Это гиперссылка называется тяжелых атомов сайтов.
Это будет скачать текстовый файл с тяжелым атомом сайтов. Измените расширение файла с txt на pdb. Откройте файл pdb в Куте.
Включите симметрию, чтобы увидеть все тяжелые атомы из соседних асимметричных единиц. Измерьте расстояния между тяжелыми атомами, в том числе через асимметричные единицы. I3C будет отображаться как равносторонний треугольник с боковой длиной шесть ангстремов.
Наличие треугольника с этими измерениями указывает на правильность размещения этих тяжелых атомов. Если подструктура запуска Auto-rickshaw неверна, другие настройки Auto-rickshaw могут быть протестированы, как это обсуждалось в письменном протоколе. Метод I3C RMMS был протестирован на двух белках, лизозиме куриного яичного белка с использованием в экране HT от Hampton Research и домена белка orf11 лизина из бактериофажа P68.
Полные экраны были настроены для каждого белка, соответствующего экрану управления без I3C или микросея, экран с микросем добавил, экран с I3C, и, наконец, экран с I3C и микросем. Добавление I3C к кристаллическому экрану, по-видимому, не увеличивает количество кристаллизации хитов. С куриным яичным белым лизозимом количество условий снизилось с 31 до 26.
С доменом Orf11 на экране управления было обнаружено одно условие удара. Добавление I3C на экран также дало один хит в тех же условиях. Добавление микросем к колодец привело к значительному увеличению числа пострадавших условий, что привело к увеличению в 2,1 и шесть раз лизозима куриного яичного белка и домена Orf11 соответственно.
Этот результат согласуется с другими исследованиями тестирования RMMS. Самое главное, добавив I3C и microseed на экране также увеличилось количество условий удара по отношению к экрану управления демонстрируя 2,3 и семь раз увеличение куриного яичного белка lysozyme и Orf11 домена соответственно. Это свидетельствует о том, что метод I3C RMMS может эффективно создать новые условия для производных кристаллов.
Кристаллы из этих условий могут быть собраны и использованы для решения кристаллической структуры. Как структура куриного яичного белка lysozyme Orf11 домена может быть решена с SAD поэтапного на auto-rickshaw трубопровода, используя аномальный сигнал от I3C демонстрации успешной производных на экране I3C RMMS. Мы представили простой и эффективный протокол для производства высококачественных кристаллов, полученных с поэтапной молекулой I3C.
Это сводит к минимуму количество экранов и кристаллических шагов обработки, и, таким образом, представляет особый интерес для структурных биологов изучения новых белков. Мы настоятельно рекомендуем оптимизировать размер кристалла путем тестирования различных разбавлений семенного запаса, которые были сделаны во время подготовки запасов семян. И этот шаг будет завершен после первоначального экраны были сделаны.
I3C широко доступен, и это недорого приобрести и, таким образом, мы считаем, что этот метод находится в пределах досягаемости большинства структурных лабораторий биологии.
Обзор
В данной статье представлен протокол кристаллизации, который оптимизирует рост белковых кристаллов с одновременной их дериватизацией I3C для рентгеноструктурного анализа. Метод использует рандомизированное экранирование матриц микросемян для улучшения условий кристаллизации.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Кристаллизация белков
- Рентгеноструктурный анализ
- Структурная биология
Фон
- Кристаллизация необходима для определения структур белков.
- Дериватизация с использованием тяжелых атомов необходима для фазовой корректировки в рентгеноструктурном анализе.
- Традиционные методы могут быть трудоемкими и затратными по времени.
- Методы микросемечения могут улучшить результаты кристаллизации.
Цель исследования
- Разработать упрощенный протокол для кристаллизации белков и их дериватизации.
- Ввести I3C в качестве молекулы для фазовой корректировки с целью улучшения определения структуры с помощью рентгеновских лучей.
- Предоставить удобный программный конвейер для решения структуры.
Использованные методы
- Приготовление растворов запасного I3C.
- Размельчение белковых кристаллов для создания микросемян.
- Настройка кристаллизационных экранов с помощью роботов для дозирования жидкостей.
- Мониторинг роста кристаллов и оптимизация условий.
Основные результаты
- Успешное получение дериватизированных белковых кристаллов.
- Улучшение условий кристаллизации с помощью микросемечения.
- Эффективное использование I3C для фазовой корректировки в рентгеноструктурном анализе.
- Автоматизация части процесса решения структуры.
Выводы
- Протокол повышает эффективность кристаллизации белков.
- Микросемечение значительно улучшает качество полученных кристаллов.
- I3C является эффективным агентом для фазовой корректировки в определении структуры.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
This protocol addresses a key bottleneck in structural biology by combining protein crystallization with heavy-atom derivatization to enable experimental phasing for novel targets. By integrating random microseed matrix screening with I3C derivatization, it reduces the number of discrete steps required to obtain phase information, accelerating early-stage target validation. The approach supports de-risking of structural hypotheses in discovery pipelines where homology models are unavailable.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables experimental phasing for novel proteins lacking homology models, supporting target validation through direct structure determination.
- Operational Value: Combines crystallization and derivatization in a single workflow, reducing hands-on time and sample handling.
- Predictive Value: The equilateral triangle arrangement of iodine atoms in I3C allows rapid validation of the anomalous substructure, increasing confidence in phased models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates derivatized crystal hits suitable for downstream data collection and phasing, enabling reliable electron density maps.
- Operational Value: Uses liquid dispensing robots to set up 96-well random microseed matrix screens, improving reproducibility and throughput.
- Scalability: Microseed stocks can be serially diluted and stored at -80°C, allowing reuse across multiple screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Provides a path from crystallization to automated structure solution via the Auto-Rickshaw pipeline, supporting preclinical target characterization.
- Mechanistic De-risking: Successful SAD phasing using I3C-derived anomalous signal validates the structural model, reducing uncertainty in target mechanism.
- Disease-Relevant System: Demonstrated on hen egg white lysozyme and Orf11 lysin domain, showing applicability to diverse protein classes including antimicrobial targets.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, linking crystallization to structure solution for targets requiring experimental phasing, particularly when computational methods fail due to lack of templates.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling 3D structure determination of novel proteins, clarifying binding sites and domain architecture.
- Screening: Produces reproducible crystallization conditions through microseeding, increasing hit rates for derivatized crystals as shown by 2.3- to 7-fold improvements over controls.
- Analytics: Outputs anomalous diffraction data suitable for SAD phasing, with substructure validation via I3C’s characteristic six-angstrom equilateral triangle.
- Translational Research: Connects to downstream validation through automated model building in Auto-Rickshaw, enabling progression to preclinical studies.
- Enterprise Reuse: Microseed stocks and I3C protocols are standardized and storable, supporting platform reuse across multiple targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides experimental phase information, reducing reliance on molecular replacement and increasing success rate for novel targets.
- Operational Value: Streamlines workflow by combining two labor-intensive steps (crystallization and derivatization) into one integrated screen.
- Strategic Value: Accelerates go/no-go decisions in target validation by enabling rapid structure determination.
- Portfolio Impact: Improves confidence in target selection through high-quality, phased structures, supporting risk-adjusted advancement.
Implementation Considerations
- Expertise in protein crystallization, microseeding, and handling of heavy atom compounds is required.
- Access to liquid dispensing robots, X-ray diffraction equipment, and structure solution software (Auto-Rickshaw, Coot) is necessary.
- Standardization across teams benefits from predefined I3C stock protocols and microseed storage procedures.
- Adaptation to different protein systems may require optimization of I3C concentration to avoid precipitation, as noted for sensitive targets.
- Practical limitations include the need for initial crystal or precipitate to generate microseeds and the dependence on sufficient anomalous signal for SAD phasing.
