Усовершенствованная очистка тканей на основе CLARITY для трехмерной организации фибробластов в здоровых и поврежденных сердцах мышей

Этот новый протокол очистки тканей улучшает существующую технологию, чтобы обеспечить более точный взгляд in vivo на конкретные типы клеток в сердце и их поведение в условиях травмы. Этот протокол быстрый и довольно простой. Это позволяет сохранять флуоресценцию marca с минимальным вмешательством от фоновой автофлуоресценции тканей, не требуя окрашивания клеток или тканей.

Начните с использования 70% марлевой прокладки, пропитанной этанолом, чтобы очистить вентральную поверхность экспериментальной мыши. Используйте хирургические ножницы, чтобы сделать трехсантиметровый поперечный разрез, примерно на три метра ниже клифового отростка и деглавировать мышь от брюшной полости к клифовому отростку, чтобы отделить кожу от подлежащей ткани брюшной стенки. Сделайте двухсантиметровый поперечный разрез в подкожной ткани брюшной стенки, на три сантиметра ниже кистевидного отростка и сделайте вертикальный разрез от этого разреза вверх по средней линии через грудную клетку.

Закрепите грудную клетку назад, чтобы обнажить сердце. И используйте 10-миллилитровый шприц, оснащенный иглой 27 калибра, чтобы ввести холодный PBS в верхнюю полую вену и аорту. Когда вся кровь будет смыта из сердца, доставить 10 миллилитров холодного 4% PFA в верхнюю полую вену и аорту, чтобы начать процесс фиксации.

Когда все фиксаторы будут мигать, иссекните сердце и используйте скальпель с прямым лезвием, чтобы отделить предсердия, правый желудочек и перегородку и левый желудочек. Поместите сердце в 15-миллилитровую коническую трубку с холодным 4% PFA для ночной инкубации при четырех градусах Цельсия на нутаторе. На следующее утро добавьте 0,25% раствор инициатора фото в свежеприготовленный раствор гидрогелей и перенесите сердце на гидрогель.

Заверните коническую трубку в фольгу для ночной инкубации при четырех градусах Цельсия без физического нарушения. На следующее утро согрейте трубку в бисероплетении 37 градусов по Цельсию в течение 2,5 часов, прежде чем использовать щипцы, чтобы аккуратно перевести сердце в 15-миллилитровую трубку PBS. Трижды вымойте сердце в PBS в течение одного часа за стирку при 37 градусах Цельсия на нутаторе и переложите сердце в корзину активного электрофореза.

Закрепите крышку на месте и заполните резервуар активной камеры электрофореза раствором для очистки электрофореза. Как только камера заполнётся, погрузьте корзину в раствор и затяните колпачок на электрофорезной машине на место. Затем запустите аппарат электрофореза при 1,5 амперах и 37 градусах Цельсия в течение 1,5 часов.

После электрофореза проверьте сердце визуально, чтобы убедиться, что не осталось непрозрачной ткани. Промыть очищенное сердце три раза по 15-миллилитр два в течение одного часа в свежем PBS при 37 градусах Цельсия за стирку на нутаторе. Перед погружением сердца в обесцвечивающее средство для уменьшения гемовой автофлуоресценции.

Через 48 часов промыть сердце три раза в PBS, как показано на демонстрации, и уравновесить сердце в свежеприготовленных RIMS в течение 48 часов до визуализации. Для 3D-визуализации очищенного сердца, во-первых, поместите тонкий слой вакуумной смазки на дно 3D-печатного нижнего резервуара, той же высоты, что и визуализируемый образец. Заполните резервуар RIMS и используйте наконечник пипетки, чтобы удалить пузырьки.

Осторожно поместите сердце в RIMS стенкой левого желудочка лицом вверх, заботясь о том, чтобы в раствор не вводились пузырьки. Используйте вакуумную смазку, чтобы прикрепить стеклянную крышку к нижней поверхности 3D-печатного верхнего куска резервуара и поместить верхнюю крышку резервуара вниз на нижние резервуары, заботясь о том, чтобы избежать пузырьков. Затем заполните верхние резервуары глицерином.

Используйте конфокальный микроскоп для изображения очищенных сердец. Сочетание усовершенствованной очистки сердечной ткани с 3D-визуализацией позволяет продвинутую детальную визуализацию сердечных фибробластов. Используя этот метод визуализации, фибробласты, как наблюдается, плотно упакованы и имеют веретенообразный морфологию в неповрежденные сердца.

После реперфузионного повреждения ишемией в течение первых трех дней после травмы наблюдается потеря сердечных фибробластов в ишемической области. К седьмому и 14-му дню фибробласты мигрировали или размножились, чтобы повторно заселить поврежденную область ткани. К 28-му дню популяция сердечных фибробластов, окружающая поврежденные участки сердца, достигла наибольшей плотности.

Через полтора дня после повреждения инфаркта миокарда в поврежденном левом желудочке остается мало фибробластов. Однако к третьему дню фибробласты расширяются и присутствуют в большей части левого желудочка. В отличие от ишемической хирургии, инфузия ангиотензина два и фенолефрина в течение нескольких недель не приводит к потере сердечной ткани и истончению стенки.

Вместо этого фибробласты выравниваются вдоль оси схемы сокращения спирали правой руки, как видно при использовании протокола очистки очищения тканей. Кроме того, после лечения ангиотензином два и фенолефрином фибробласты кажутся маленькими и округлыми, в отличие от формы веретена, наблюдаемой в моделях репрофузии ишемии и повреждения инфаркта миокарда. Электрофоретическая очистка должна выполняться осторожно, особенно при работе с сердцами, которые подверглись протоколам травмы.

Этот протокол может быть использован для оценки того, как сердечные фибробласты реагируют на травму in vivo. Различные флуоресцентные маркеры также могут быть использованы, чтобы понять, как сердце реагирует на травму на клеточном уровне.