Наблюдение за функцией островков и взаимодействием островковых и иммунных клеток в живых срезах ткани поджелудочной железы
12 апреля 2021 г.
В этом исследовании представлено применение живых срезов ткани поджелудочной железы для изучения физиологии островков и взаимодействия островковых и иммунных клеток.
Наш протокол поможет ответить на влияние, которое иммунные клеточные взаимодействия оказывают на функциональность островков. Метод среза живой ткани поджелудочной железы позволяет изучать физиологию и функцию островков при сохранении тканей, лежащих в основе патологий, и нативной микросреды. Этот метод может дать представление о болезненных процессах заболеваний поджелудочной железы, таких как панкреатит, диабет I типа и диабет II типа.
Для начала расположите блоки на держателе образца таким образом, чтобы они не превышали ширину лезвия, гарантируя, что лезвие может двигаться вперед на минимально возможное расстояние, когда вибратом движется медленно. Нанесите линию суперклея на держатель образца, сделав тонкий слой с помощью конца дозатора клея, затем переверните блоки тканей на клей так, чтобы сторона, близкая к ткани, была обращена вверх. Аккуратно надавите на блоки и дайте клею высохнуть в течение трех минут.
Затем прикрепите пластину к вибратому с помощью винта и отрегулируйте высоту и расстояние, которое перемещается так, чтобы лезвие двигалось по длине блоков и чуть выше них. Осторожно подталкивайте блоки щипцами, чтобы убедиться, что клей высох, а затем заполните лоток вибратома охлажденным внеклеточным раствором, пока лезвие не будет покрыто. Установите вибратом, чтобы сделать срезы толщиной 120 микрометров и запустите его, затем наблюдайте за срезами, отрывающимися от тканевых блоков.
Поднимите ломтики, когда они выплывают из блока, поместив под них кисть или щипцы, и поместите ломтики в бикарбонатный буфер Кребса-Рингера, содержащий три миллимоляра D-глюкозы и ингибитор трипсина. Поместите пластины, содержащие ломтики, на коромысл и инкубируйте при комнатной температуре в течение часа при 25 оборотах в минуту. Если ломтики нужно хранить дольше, поместите ломтики в 15 миллилитров ломтик-культуральной среды и поместите пластину в инкубатор.
Инкубируйте подготовленные ломтики при 37 градусах Цельсия для исследований в тот же день или перенесите ломтики, которые культивируются при 24 градусах Цельсия в течение ночи, до 37 градусов Цельсия в течение по крайней мере одного часа до эксперимента. Включите микроскоп по крайней мере за час до записи и уравновесьте верхнюю часть инкубатора до 37 градусов Цельсия. Закрепите на сцене стеклянную нижнюю чашку Петри, содержащую ломтик.
Сфокусируйте микроскоп, установив объектив 10X в режиме яркого поля, и найдите островки в режиме яркого поля, выполнив поиск оранжево-коричневых овалов внутри среза. Переключите микроскоп на конфокальную визуализацию, нажав кнопку CS на контроллере сенсорного экрана микроскопа. Для просмотра островков с использованием отражательной способности включите лазерный детектор 638 и детектор PMT.
Установите мощность лазера от одного до 2% и выключите выемчатые фильтры. Используйте 405-нанометровый лазер и детектор PMT для наблюдения за окрашиванием нуклеиновых кислот. Гибридный детектор для обнаружения антител CD8 и 488-нанометровый лазерный и гибридный детектор для просмотра тетрамера инсулина.
Центрируйте интересующий островок в поле зрения с помощью ручек X и Y контроллера сцены. Как только интересующий островок будет найден, переключитесь на цель 20X и увеличьте масштаб, чтобы островок занимал большую часть кадра. Возьмите z-стек островка, затем найдите лучшие оптические участки, где клетки живы и любые окружающие иммунные клетки находятся в фокусе.
Установите микроскоп для записи в режиме XYZT и оптимизируйте настройки для записи z-стека выбранных шагов каждые 20 минут в течение нескольких часов. Островки в срезе ткани поджелудочной железы были визуализированы с использованием микроскопии яркого поля и отраженного света. Инсулин в островках увеличивает зернистость и вызывает поглощение большого количества отраженного света, увеличивая видимость островков.
Жизнеспособность живого среза ткани поджелудочной железы человека оценивали путем окрашивания. Живые клетки обозначены зеленым цветом, а мертвые клетки — синим. Еще одним положительным показателем жизнеспособности является наблюдаемая базальная активность.
Когда живой срез поджелудочной железы был загружен клеточным проницаемым индикатором кальция, стимуляция глюкозой наблюдалась как в мышиных, так и в человеческих срезах поджелудочной железы. Флуоресценция отдельных клеток во время стимуляции глюкозой также была количественно определена. Интактные и больные островки наблюдались с помощью окрашивания дитизоном и микроскопии отраженного света.
Больные островки начинают терять зернистость из-за инфильтрации иммунных клеток и гибели клеток. Популяции иммунных клеток могут быть идентифицированы с помощью антител CD8 и окрашивания тетрамера инсулина. Совместное окрашивание указывает на то, что клетки являются эффекторными Т-клетками, которые специфически нацелены на антиген инсулина.
Самое важное, что нужно помнить в этой процедуре, это постоянно держать срезы в растворах ингибитора протеазы. После этой процедуры могут быть выполнены многочисленные функциональные возможности в экспериментах с иммунными клетками, позволяющие изучить влияние взаимодействия иммунных клеток и функцию островков.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
Это исследование представляет применение живых срезов поджелудочной ткани к изучению физиологии островков поджелудочной железы и взаимодействий островков с иммунными клетками. Метод позволяет исследовать функциональность островков, сохраняя естественную среду обитания.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Иммунология
Предыстория
- Клетки островков играют важную роль в метаболизме глюкозы.
- Взаимодействия иммунных клеток могут влиять на функционирование островков.
- Понимание этих взаимодействий важно для решения панкреатических заболеваний.
- Живые тканевые срезы поддерживают физиологическую среду клеток.
Цель исследования
- Исследовать влияние взаимодействий иммунных клеток на функциональность островков.
- Предоставить представление о панкреатических заболеваниях, таких как диабет типа I и типа II.
- Разработать метод, сохраняющий патологии тканей и микроокружения.
Используемые методы
- Приготовление живых срезов поджелудочной ткани.
- Использование вибратома для точного нарезания.
- Применение суперклея для стабилизации тканевых блоков.
- Наблюдение за взаимодействиями островков и иммунных клеток в реальном времени.
Основные результаты
- Метод живых срезов поджелудочной ткани эффективно сохраняет физиологию островков.
- Было показано, что взаимодействия иммунных клеток значительно влияют на функционирование островков.
- Этот подход позволяет изучать лежащие в основе патологии.
- Полученные результаты могут оказать влияние на стратегии лечения панкреатических заболеваний.
Выводы
- Живые срезы поджелудочной ткани являются ценным инструментом для изучения физиологии островков.
- Метод может улучшить понимание иммунных взаимодействий в функционировании островков.
- Будущие исследования могут опираться на эти результаты для решения панкреатических расстройств.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Live pancreatic tissue slices enable direct observation of islet-immune cell interactions within a preserved native microenvironment, offering a physiologically relevant system for mechanistic de-risking in diabetes target validation. This approach supports predictive confidence by maintaining tissue viability and underlying pathologies such as type 1 and type 2 diabetes, allowing R&D teams to assess therapeutic hypotheses in a disease-relevant context. The method bridges discovery biology and translational research by providing quantitative, real-time readouts of islet function and immune cell dynamics critical for go/no-go decisions in early diabetes drug discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing immune cell infiltration and its direct impact on islet granule integrity and insulin release.
- Operational Value: Preserves native tissue architecture and cellular interactions, reducing mechanistic ambiguity in target validation for immunomodulatory diabetes therapies.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by linking immune cell activity to functional islet decline, providing a biomarker-aligned readout for target engagement.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative fluorescence readouts from calcium indicators and insulin tetramer staining to assess dose-dependent compound effects on islet function.
- Operational Value: Standardizes tissue preparation and imaging protocols, ensuring reproducible baseline measurements across experimental runs and model systems.
- Scalability: Compatible with time-lapse microscopy and z-stack acquisition, enabling longitudinal monitoring of immune cell dynamics over several hours.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Maintains underlying pathologies from human and mouse pancreatic tissue, allowing study of type 1 and type 2 diabetes mechanisms in a disease-relevant system.
- Translational Continuity: Connects early discovery findings to preclinical validation by preserving intercellular interactions critical for immune-mediated islet dysfunction.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables visualization of effector T-cell interactions with insulin antigens via CD8 and insulin tetramer co-staining, supporting mechanism-based go/no-go decisions.
Pipeline & Workflow Integration
The live pancreatic tissue slice method fits within the discovery continuum from target validation through preclinical research, providing a disease-relevant system that maintains tissue viability and microenvironment for mechanistic studies of islet-immune interactions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling real-time observation of immune cell impact on islet physiology, clarifying pathways involved in diabetes pathogenesis.
- Screening: Delivers assay-ready tissue slices with quantitative outputs from glucose-stimulated calcium flux and insulin tetramer binding, facilitating reliable compound evaluation.
- Analytics: Generates XYZT time-lapse data and z-stack optical sections, allowing teams to quantify cellular responses and immune cell localization over time.
- Translational Research: Maintains disease-relevant pathologies and native microenvironment, supporting continuity from discovery through preclinical validation of immunomodulatory mechanisms.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying islet function across multiple disease models and therapeutic modalities, reducing redundant model development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through direct visualization of islet-immune interactions in intact tissue.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility via controlled slicing, incubation, and imaging protocols that maintain slice viability and function.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking immune cell activity to functional islet decline, reducing late-stage biological risk in diabetes drug development.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of immunomodulatory candidates based on their ability to mitigate immune-mediated islet dysfunction in a disease-relevant system.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue handling, vibratome sectioning, and confocal microscopy for live imaging of immune cell dynamics.
- Dependent on instrumentation including a vibratome, confocal microscope with laser detectors (405nm, 488nm, 638nm), and stage-top incubator for environmental control.
- Necessitates cross-team standardization of slice preparation, buffer composition (Krebs-Ringer bicarbonate with D-glucose and trypsin inhibitor), and incubation conditions to ensure reproducibility.
- Involves adaptation considerations when applying the method to different model systems (human vs. mouse) or disease states (T1D vs. T2D) to maintain tissue viability and pathological relevance.
- Includes practical limitations such as the need for protease inhibitors to preserve slice integrity and the technical challenge of maintaining optical clarity during long-term time-lapse imaging.
