Нанодиафродная сканирующая флуориметрия для скрининга при обнаружении свинца на основе фрагментов

Этот протокол полезен для кампаний по обнаружению лидов с фрагментированной базой в качестве дополнительного инструмента для выбора перспективных фрагментов в качестве кандидатов на тепло. Nano DSO для скрининга фрагментов использует ограниченное количество немаркированного образца белка и может обычно использоваться почти для всех белковых мишеней. Этот метод можно использовать для скрининга любых коллекций лигандов.

или для проверки нагрева другими методами. Вынимайте фрагментную пластину из морозильной камеры минус 20 или минус 80 градусов цельсия и дайте ей оттаять при комнатной температуре с легким встряхиванием на шейкере. Центрифугирование пластины в 500 раз G в течение 30 секунд для сбора любых капель, прилипающих к боковой части колодцев.

Возьмите кристаллизующие пластины MRC с 2 лунками и пипетку 15 микролитров белкового раствора в каждую подлунку с помощью многоканальной пипетки. Чтобы проверить определения фрагментов и белковых пластин на Mosquito, включите нанодиспенсер и убедитесь, что вокруг движущихся компонентов нет препятствий. Откройте графический интерфейс пользователя, перейдите на вкладку Setup и в разделе Deck Configuration проверьте, присутствует ли уже в списке доступных пластин тип пластины, в которую поставляются соединения, и та, в которую переносится белок.

Если нет, щелкните Параметры, а затем Пластины и создайте новое определение пластины, заполнив правильные значения для типа свойства. На вкладке Настройка укажите положение пластин в разделе Конфигурация палубы. Используя раскрывающееся меню, выберите нижнюю панель Grainier U для первой позиции и пластину MRC 2-well для второй позиции и сохраните протокол.

Поместите фрагментную пластину в положение один, а белковую пластину во вторую позицию палубы. На вкладке протокола нажмите Файл и выберите протокол, сохраненный на предыдущем шаге для раздачи фрагментов. Определите объем дозируемых фрагментов как 0,3 микролитра.

Для типичной пластины, где столбцы первый и 12 не содержат фрагментов, определите начальное расположение для второго столбца и конечное расположение для столбца 11. В некоторых табличках, если столбцы два или 11 пусты, используйте столбцы три и 10 в качестве начального и конечного значений. Нажмите кнопку Выполнить, чтобы запустить программу.

После дозирования, которое занимает около двух минут, удалите белковые и фрагментные пластины из робота и запечатайте их клейкой герметизной пленкой. Кратковременно центрифугируют белковую пластину в 500 раз G в течение 30 секунд, чтобы собрать любую каплю, прилипшую к сторонам скважин, прежде чем перейти к следующему шагу. Визуально осмотрите колодцы белковой пластины на предмет осадков, которые могли произойти из-за добавления фрагментов.

Если осадки наблюдаются во многих скважинах, уменьшите концентрацию осколков и повторите эксперимент. Включите инструмент «Прометей». На сенсорном экране нажмите Открыть ящик для доступа к капиллярной загрузочной модулю прибора.

Снимите магнитную полосу с загрузочного модуля и очистите зеркало этанолом, чтобы удалить частицы пыли. Чтобы перенести раствор с пластины фрагментов белка на капилляры, поместите белковую пластину и капилляры рядом с инструментом для легкого доступа к капиллярному загрузочному модулю. Возьмите один капилляр, удерживая его на одном конце, и коснитесь раствора в белковой пластине другим концом капилляра, чтобы перенести образец.

Всегда надевайте перчатки и следите за тем, чтобы не касаться капилляра посередине, так как примеси из перчаток повлияют на измерение. Поместите капилляр в назначенное положение держателя, убедившись, что он правильно выровнен и центрирован, повторите эти шаги, чтобы заполнить все позиции в загрузочном модуле. В конце поместите магнитную полосу поверх капилляров, чтобы удержать их на месте, и нажмите Close Drawer, чтобы начать эксперимент Nano-DSF.

Откройте приложение Prometheus PR. ThermControl и создайте новый проект, щелкнув Начать новый сеанс. Во-первых, сделайте сканирование обнаружения, чтобы обнаружить флуоресценцию образцов. Измените флуоресцентный сигнал образцов, регулируя мощность возбуждения лазера.

Для термической денатурации нажмите на вкладку Melting Scan, установите начальную температуру на 20 градусов Цельсия, конечную температуру на 95 градусов Цельсия и температурный наклон на один градус Цельсия в минуту. Затем нажмите «Начать измерение». Здесь показано частотное распределение сдвига и температуры плавления для наружного, кинетического или высоко экспрессированного при раке одного белка, регуляторного тетратрикоптидного повторного домена монополярной веретениновой киназы 1 и SARS-CoV-2 3c-подобной протеазы.

Отрицательные значения указывают на снижение температуры плавления в присутствии фрагмента, в то время как положительное значение указывает на повышение температуры плавления. Для Nsp5 все фрагменты оказывают дестабилизирующее действие, тогда как для Hec1 и Mps1 наблюдаются как стабилизирующее, так и дестабилизирующее попадание. Это дешевый и быстрый метод проверки библиотек фрагментов.

Другие методы, такие как ЯМР или рентгеновская кристаллография, могут показать точное связывание фрагментов, и они также доступны через открытие INX. Результаты с протеазой коронавируса помогли предложить новые соединения, которые могут быть разработаны в лекарства против COVID-19.