Высокопроизводительный анализ in vitro с использованием органоидов опухолей, полученных от пациента

Полученные от пациента опухолевые органоиды точно повторяют архитектуру и функцию опухолевой ткани с лучшей воспроизводимостью заболевания. Таким образом, реакция пациента на противораковые препараты может быть точно оценена с использованием этой модели. Опухолевые органоиды непригодны для системы анализа in vitro с высокой пропускной способностью или анализа клеток из-за образования больших кластеров в культуре.

С использованием этой методики была разработана простая и более точная HTS для оценки молекулярных таргетных препаратов. Поскольку органоидная культура сильно отличается от 2D-культуры, сначала можно запутаться в культуре, но важно внимательно наблюдать за морфологическими изменениями органоидов. После удаления замороженной мерзкой из хранилища жидкого азота осторожно перемешайте полученные пациентом органоиды опухоли на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия в течение одной минуты.

Снимите мерзкий с водяной бани и протрите 70% этанолом. Затем поместите флакон в шкаф для биобезопасности. Перенесите органоиды опухоли в 15-миллилитровую трубку, содержащую среду для органоидов.

Используйте трехмиллилитровую передаточную пипетку, чтобы аккуратно смешать органоиды опухоли и среду, пипетируя вверх и вниз пять раз. Гранулирование опухолевых органоидов путем центрифугирования. Отбросьте супернатант и повторно суспендируйте опухолевую органоидную гранулу в пяти миллилитрах свежей среды.

Переложите суспензию органоида опухоли в колбу T25 и инкубируйте при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа. После одной недели первого прохождения перенесите суспензию органоида опухоли из двух колб T25 в две центрифужные трубки и гранулируйте органоиды опухоли путем центрифугирования. Оцените объем опухолевой органоидной гранулы и повторно суспендируйте гранулу в 2,5 миллилитрах свежей среды на пробирку.

Объедините органоидную суспензию опухоли в одну трубку. Переложите объединенную суспензию в колбу T75, содержащую 10 миллилитров свежей среды, и инкубируйте при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа. После 24 часов изменения среды измельчите органоиды опухоли с помощью инструмента фрагментации и дисперсии клеток, оснащенного фильтродержателем, содержащим 70-микрометровый сетчатый фильтр.

Развести 15 миллилитров опухолевой органоидной суспензии 10 раз. Используйте диспенсер клеточной суспензии для посева 40 микролитров разбавленной органоидной суспензии опухоли в 384-луночную сфероидную микропластину со сверхнизким прикреплением. Через 24 часа используйте жидкий обработчик, чтобы добавить 0,04 микролитра растворов тестируемого агента из 10 последовательных разведений в конечных диапазонах концентраций от 20 микромоляров до 1,0 наномоляров в скважинах и инкубировать пластину в течение шести дней.

В конце инкубации добавляют внутриклеточный реагент для измерения АТФ в испытательные скважины. Используйте миксер, чтобы перемешать содержимое тарелки и инкубировать пластину в течение 10 минут при температуре около 25 градусов Цельсия. Используйте пластинчатый считыватель для измерения внутриклеточного содержания АТФ в виде люминесценции.

Через 24 часа третьего прохода поместите 384-луночную ультранизкую сфероидную микропластину со 40 микролитрами среды на скважину в качестве целевой пластины на систему сбора и визуализации клеток. Постройте камеру сбора с шестью миллилитрами питательной среды и центрифугой по 1 500 G в течение двух минут, чтобы удалить пузырьки воздуха. Добавьте четыре микролитра суспензии органоидов опухоли в камеру сбора и установите камеру отбора на систему.

Дайте кластерам клеток осесть в нижней части камеры в течение одной минуты после диспергирования, а затем начните сканирование камеры. Установите размер подбора от 140 до 160 микрометров в системе автоматического отбора кластеров ячеек. Затем проверьте качество выбранных кластеров клеток на отсканированных изображениях и перенесите 10 кластеров ячеек на скважину с помощью наконечников для отбора в целевую пластину.

В текущем исследовании оценивалось влияние противораковых средств на органоид опухоли, полученный от пациента. На высокую чувствительность для всех противоопухолевых агентов указывали половинные максимальные значения ингибирующей концентрации менее двух микромоляров в области под кривыми значениями менее 282. Для оценки антителозависимой клеточной цитотоксичности измеряли процент цитолиза органоидов опухоли в присутствии двух разных антител.

Процент цитолиза увеличивался со временем. Без антител через шесть часов с соотношением эффектор-клетка-мишень один к одному цитолиз достиг 45%В то время как при соотношении два к одному цитолиз достиг 70% Естественный цитолиз клеток-киллеров с использованием трастузумаба составлял примерно 60% при соотношении эффектор-клетка-мишень один к одному и 80% в соотношении два к одному через шесть часов. Напротив, цетуксимаб оказывал дозозависимое воздействие на естественный цитолиз, опосредованный клетками-киллерами.

При самой высокой концентрации цетуксимаба наблюдался 90%-ный цитолиз при соотношении эффектор-клетка-мишень один к одному, а 100% цитолиз наблюдался при соотношении два к одному, что свидетельствует о высокой эффективности цетуксимаба. Высокопроизводительная система анализа с использованием опухолевых органоидов, полученных от пациента, превосходит оценку потенциальных противораковых агентов и предоставляет возможности для оценки лекарств и достижений в персонализированной медицине.