Водородно-дейтериевый обмен на основе капиллярного электрофореза для конформационной характеристики белков с помощью масс-спектрометрии сверху вниз
8 июня 2021 г.
Здесь представлен протокол для подхода на основе капиллярного электрофореза на основе водорода / дейтерия (HDX) в сочетании с масс-спектрометрией сверху вниз. Этот подход характеризует различие в структурах более высокого порядка между различными видами белков, включая белки в разных состояниях и различные протеоформы, путем проведения одновременного дифференциального HDX и электрофоретического разделения.
Этот метод позволяет разделить сосуществующие виды белка, включая различные конформеры или варианты, и онлайн-характеристику их различий в структуре более высокого порядка, которые должны быть завершены в одном измерении CEMS. Он использует электрофоретический эффект, чтобы обеспечить почти 100% продолжительность среды для реакций HDX и ортогонального разделения сосуществующих белковых форм во время HDX для анализа РС сверху вниз. Начните с предварительного кондиционирования капиллярного электрофореза, водородного дейтериевого обмена или установки CE HDX.
Используя ультразвук в смеси 50% метанола, 49% воды и 1% муравьиной кислоты, очищают поток через микроволиальный интерфейс CE-MS в течение не менее 30 минут при комнатной температуре. Установите модифицированный капилляр HPC на капиллярный электроферез или инструмент CE. Промыть капилляр фоновым раствором электролита или БГЭ в течение 10 минут с помощью автопробоотборника и оставить его заполненным БГЭ.
Используйте подходящую длину немодифицированной плавленой капиллярной трубки кремнезема в качестве инфузионной трубки для раствора модификатора. Используйте соединение и соответствующую втулку для подключения трубки модификатора к газонепроницаемому стеклянному шприцу с тупой температурой и промывайте трубку раствором модификатора в течение не менее 10 минут с помощью инфузионного насоса. Вставьте в очищенный интерфейс CE-MS выпускные отверстия капиллярной и модификаторной трубки HPC, загруженные соответствующими решениями.
Выдвигайте шприц с помощью инфузионных насосов таким образом, чтобы раствор модификатора достигал кончика интерфейса. Установите собранный интерфейс CE-MS на корпус источника ионизации наноэлектронного распыления масс-спектрометра. Нанесите напряжение распыления 3-5 киловольт на интерфейс CE-MS.
Настаивайте раствор модификатора с инфузионным насосом со скоростью потока от 0,1-10 микролитров в минуту и обеспечьте стабильное электрораспыление на кончике интерфейса CE-MS. Поместите флакон с образцом, содержащий BGE и автоматический пробоотборник, который будет использоваться позже для получения пустых электроферограмм и пустых масс-спектров. Оцените объем впрыска, используя соотношение между объемом впрыска и параметрами впрыска.
И вводите образец раствора с помощью автоматического пробоотборника при двух PSI в течение соответствующего периода времени. Начните разделение СЕ с подачи электрофоретического напряжения 20 киловольт в давлении инфузии в диапазоне от 0-2 фунтов на квадратный дюйм и получите электроферограмму. Между тем, получение данных МС в хроматографическом режиме, где график ионного тока получается в зависимости от времени, а соответствующие сканирования МС не объединяются автоматически в единый спектр.
Сохраните пустую электроферограмму и масс-спектры в качестве ссылок. Поместите флаконы с образцами, содержащие желаемые концентрации растворов образца белка, в автопробоотборник и получите электроферограммы и спектры MS1 электрофоретически разделенных и меченых дейтером белковых видов. Выполняйте тандемные измерения Ms.для интересующих видов либо после приобретения спектров MS1 в рамках того же прогона, либо в последующем отдельном прогоне.
После каждого измерения промывайте капилляр БГЭ при давлении 20 фунтов на квадратный дюйм в течение не менее 10 минут. Очистите интерфейс CEMS и все трубки для хранения после завершения экспериментов. Получение набора данных образца конечной точки HDX с помощью MS в режиме прямой инфузии.
Низкое инфузионное давление привело к лучшему разделению пиков CE, но привело к увеличению как времени миграции, так и продолжительности эксперимента. Более длительное время реакции HDX привело к более высокому уровню дедурации белковых аналитов. Дисперсия А и В бета-иммуноглобулина или бета-IG, которые отличаются только двумя аминокислотными остатками в их последовательности, привели к появлению двух адекватно разделенных пиков в электроферограмме, полученной из EIC.
Дифференциальная дисперсия, меченая дейтерием, привела к отчетливому массовому распределению ионов. Наблюдалось более низкое число в относительном изобилии ионов Z, чем ионов C, из-за уникальной дисофированной связи в подтверждении бета-IG, которая ограничивает эффективность фрагментации между CS 82 и CS 176. Большинство фрагментов ионов, полученных из бета-IGA и бета-IGB, демонстрируют одинаковую степень поглощения дейтерия.
Однако более крупные сегменты, охватывающие участки вариации последовательностей из бета-IGA, были дедурированы в значительно большей степени, чем бета-IGB. pH BGE регулируется в соответствии с изоэлектрической точкой образца, чтобы предотвратить агрегацию белка и облегчить разделение при сохранении комплекса.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе описывается метод обмена водорода на дейтерий (HDX) на основе капиллярного электрофореза в сочетании с масс-спектрометрией top-down. Он позволяет определять различия в структуре высшего порядка между различными видами белков, включая разные состояния и протеоформы, путем одновременного дифференциального HDX и электрофоретического разделения.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Биохимия
- Масс-спектрометрия
- Химия белков
Теоретические основы
- Капиллярный электрофорез (КЭ) представляет собой мощный метод разделения биомолекул.
- Гидроген-дейтериевый обмен (HDX) позволяет получить сведения о динамике и структуре белков.
- Масс-спектрометрия «сверху вниз» (top-down) позволяет анализировать интактные белки и их варианты.
- Данный метод позволяет анализировать несколько конформеров белка за одно измерение.
Цель исследования
- Разработка метода анализа структур белков высшего порядка.
- Облегчение разделения сосуществующих форм белков.
- Повышение эффективности измерений HDX за счет электрофоретического разделения.
Используемые методы
- Предварительная подготовка установки для капиллярного электрофореза.
- Ультразвуковая обработка интерфейса КЭ-МС в смеси метанола, воды и муравьиной кислоты.
- Промывка капилляра раствором фонового электролита.
- Проведение реакций HDX в контролируемой среде во время электрофореза.
Основные результаты
- Успешное разделение различных конформеров белка.
- Характеристика структурных различий за одно измерение CEMS.
- Продемонстрированная эффективность метода для анализа в режиме реального времени.
- Получение данных о динамике белковых форм.
Выводы
- Метод CE HDX эффективен для изучения структуры белков.
- Данный подход может быть применен к различным видам и состояниям белков.
- Он обеспечивает оптимизированный процесс анализа динамики белков.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Разрешение конформационной гетерогенности терапевтических белков остается критической проблемой в биофармацевтических исследованиях и разработках, особенно при характеристике структур высшего порядка и динамики сосуществующих состояний белка. Данный метод обмена водорода на дейтерий на основе капиллярного электрофореза (CE-HDX) позволяет проводить конформер-специфический анализ структурных различий белков в рамках одного измерения, что способствует валидации мишеней и снижению механистических рисков на ранних этапах поиска. Благодаря интеграции электрофоретического разделения с масс-спектрометрией «сверху вниз» (top-down MS), данный подход повышает прогностическую уверенность в поведении белка и служит основой для принятия решений о целесообразности дальнейшей разработки в процессе идентификации ведущих соединений.
Стратегические применения в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверить терапевтические гипотезы путем выявления конформационных различий между вариантами белков и протеоформами.
- Операционная ценность: обеспечивает функциональную валидацию мишени посредством характеристики конформер-специфичной структуры высшего порядка.
- Прогностическая ценность: повышает уверенность в выборе мишени за счет выявления структурной динамики, имеющей значение для биологической функции.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: Подготовка биологически значимых белковых систем для последующего скрининга путем разделения и характеристики сосуществующих состояний.
- Количественные данные: Предоставление измерений дейтерирования на глобальном уровне и уровне фрагментов, что позволяет проводить количественное сравнение конформеров белка.
- Воспроизводимость: Минимизация остаточного протонного растворителя во время HDX, что создает среду с почти полным дейтерированием для получения стабильных результатов.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: Связывает данные о конформации, полученные на этапе фундаментальных исследований, с доклинической валидацией путем характеристики динамики белков в растворе.
- Механистическая минимизация рисков: Проясняет взаимосвязь между структурой и функцией в вариантах белков, уменьшая неопределенность при оптимизации ведущих соединений.
- Согласование с биомаркерами: Способствует идентификации конформационных биомаркеров, связанных с функциональными исходами в системах, имеющих значение для конкретных заболеваний.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Данный метод вписывается в континуум открытий — от ранней валидации мишеней до идентификации соединений-лидеров, при этом разрешение конформации служит основой для белковой инженерии и кампаний по скринингу.
- Фундаментальная биология: обеспечивает проверку гипотез путем разделения и анализа сосуществующих конформеров белков в условиях, близких к нативным.
- Скрининг: позволяет стандартизировать анализ за счет получения воспроизводимых количественных структурных данных для различных форм белков.
- Аналитика: предоставляет данные об общем уровне дейтерирования и специфических паттернах поглощения фрагментов, что облегчает сравнительный анализ состояний белка.
- Трансляционные исследования: связывает структурную динамику с функциональными результатами, что помогает принимать обоснованные решения о продвижении разработки с учетом рисков.
- Корпоративное использование: служит многократным использованием платформы для характеристики гетерогенности белков по нескольким мишеням и проектам.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозирования поведения белков за счет разрешения конформационной гетерогенности.
- Операционная ценность: Повышает воспроизводимость и масштабируемость благодаря автоматизированной интеграции CE-MS и минимизации артефактов, вызванных растворителями.
- Стратегическая ценность: Повышает качество принятия решений о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go) за счет снижения неопределенности механизмов действия белковых мишеней.
- Влияние на портфель: Обеспечивает приоритизацию белковых кандидатов с учетом рисков на основе их структурной стабильности и динамики.
Особенности реализации
- Требуются экспертные знания в области капиллярного электрофореза, масс-спектрометрии и принципов HDX-масс-спектрометрии белков.
- Результат зависит от совместимости интерфейса CE-MS, оптимизации фонового электролита и подачи раствора модификатора.
- Необходима межкомандная стандартизация параметров гашения HDX, денатурации и регистрации данных МС.
- Требуется учет особенностей адаптации для белков различного размера, заряда и растворимости в условиях электрофореза.
- Время анализа ограничено при низком давлении инфузии, которое улучшает разделение, но увеличивает продолжительность эксперимента.
