Хемилюминесцентные анализы для обнаружения оксида азота и его производных от аутоксидации и нитрозированных соединений

Этот протокол позволяет исследователям умело использовать детектор хемилюминесценции для измерения метаболитов оксида азота без руководства или затрат на использование специального персонала на месте. Анализ на основе хемилюминесценции является наиболее чувствительным методом для обнаружения минимальных изменений уровней оксида азота и его метаболитов в любом данном биологическом образце. Ингаляционный оксид азота является лечебным газом, используемым при самых разнообразных заболеваниях.

Крайне важно, чтобы прогрессирование заболевания и выздоровление были точно коррелированы с уровнями метаболитов оксида азота. Ингаляционный оксид азота, противомикробное средство, показывает перспективность в лечении пациентов с инфекционными заболеваниями дыхательных путей. Метод хемилюминесценции дает представление о корреляции дозы оксида азота и его метаболитов с микробиологическими и патофизиологическими изменениями.

Чтобы приготовить раствор DETA-NONOate, добавьте 10 миллиграммов DETA-NONOate к 610 микролитрам 10-миллимолярного гидроксида натрия в PBS рН 7,4, чтобы получить 100 миллимоляров DETA-NONOATE и сохранить его на льду. Чтобы продолжить, подключите кислородную линию к детектору хемилюминесценции и откройте кислородный баллон под давлением в соответствии с инструкцией завода-изготовителя, приведенной в тексте. Затем подключите линию диэлектрического фильтра интенсивного поля к детектору хемилюминесценции.

На интерфейсе детектора хемилюминесценции запустите программу обнаружения анализов жидкой фазы, убедившись, что подача кислорода достаточна, и детектор начнет отбор проб, указывающий на обнаружение сигналом в милливольтах, в противном случае вызвать отрицательный диагностический сигнал. Чтобы подготовить продувочный сосуд, закройте продувочный сосуд на всех трех портах, полностью прикрутив игольчатый клапан вправо и закрыв впускной и выпускной петухи. Снимите колпачок с продувочного сосуда.

Добавьте достаточное количество реагента, специфичного для запланированного анализа, в реакционную камеру, чтобы шприц-игла, используемая для введения образцов, могла достичь колонки жидкости, проверяя при этом наличие стабильного, желаемого исходного уровня. Чтобы запустить поток продувочного газа, убедитесь, что резервуар для инертного газа оснащен двухступенчатым регулятором, и соедините резервуар для инертного газа с газовым входом сосуда. Затем откройте выходное отверстие продувочного сосуда и откройте газ с давлением на выходе у регулятора от одного до пяти фунтов на квадратный дюйм.

Затем откройте входное отверстие продувочного сосуда и медленно откройте игольчатый клапан продувочного сосуда, чтобы обеспечить приток газа и проверить пузырьки в продувочном сосуде. Чтобы отрегулировать поток газа, запишите давление в ячейке, измеренное детектором хемилюминесценции, с помощью линии диэлектрического фильтра интенсивного поля для отбора проб окружающего воздуха. Переставьте колпачок на продувочный сосуд и подключите линию диэлектрического фильтра интенсивного поля к продувочному сосуду.

Используйте игольчатый клапан для достижения того же давления в клетке на уровне детектора хемилюминесценции, которое регистрируется в окружающем воздухе. Чтобы запустить программу получения сигнала хемилюминесценции, подключите последовательный порт детектора хемилюминесценции к последовательному порту компьютера, в который установлена программа сбора. Затем запустите программу анализа.

Нажмите «Получить», затем выберите папку для сохранения файла данных, введите имя файла и нажмите «Сохранить». Во время подготовки к впрыску образца отрегулируйте шкалу напряжения на экране, чтобы иметь контроль над целевой базовой линией, нажав на минимальную и/или максимальную кнопки, а затем введя желаемое значение. Чтобы выполнить инъекцию образца, промойте шприц по крайней мере дважды или более деионизированной и дистиллированной водой перед изъятием каждого образца и обеспечьте беспрепятственный выброс воды на заданную салфетку.

Затем вставьте шприц в пробу, удерживая шприц и трубку на близком расстоянии, и подтяните плунжер до нужного объема, гарантируя, что пузырь воздуха или негомогенизированные твердые части не будут захвачены. Очистите наконечник шприца с помощью стеклоочистителя и вставьте шприц в колпачок сеттера в инжекторном отверстии. Убедившись, что наконечник шприца находится в жидкой фазе, введите образец в реакционную камеру.

Чтобы отметить инъекцию в программном обеспечении, введите имя образца, щелкнув серое поле в разделе «Имена образцов», затем нажмите «Mark Injection», убедившись, что инъекция вызывает изменение сигнала в сторону повышения или уменьшения потребления оксида азота бесклеточным анализом гемоглобина. Зависимость дозового ответа между бесклеточным гемоглобином и потреблением оксида азота измеряли с помощью хемилюминесценции после сердечно-легочного шунтирования. Можно предположить, что наблюдается высокая концентрация гемовых групп в окисленном состоянии поглощающего оксид азота.

У пациентов, получающих оксид азота во время сердечно-легочного шунтирования, вместо этого большинство гемовых групп снижается и не потребляет оксид азота. Измерения концентрации бесклеточного гемоглобина указывали на медленное выведение из плазмы в течение 12 часов после сердечно-легочного шунтирования. Однако потребление оксида азота достигло пика через 15 минут и не отражало элиминацию бесклеточного гемоглобина.

Линейные регрессионные кривые потребления оксида азота бесклеточным гемоглобином показали преобладание окисленного и потребляющего оксид азота гемоглобина через 15 минут, в отличие от более сниженного гемоглобина на исходном уровне 4 часов и 12 часов после сердечно-легочного шунтирования. Контролировалось влияние введения газа оксида азота на потребление оксида азота. Когда пациентов лечили газом оксида азота внутри- и послеоперационно, наблюдаемое повышение свободного гемоглобина после сердечно-легочного шунтирования не сочеталось с каким-либо увеличением потребления оксида азота.

Результаты показали, что экзогенно вводимый оксид азота восстанавливал большую часть свободного гемоглобина и предотвращал удаление оксида азота. Эксперимент действителен только в том случае, если все условия остаются неизменными. Если высота уровня жидкости превышает реакционную колонну, мы должны остановиться и провести новую калибровку.