Протокол на основе лазерной микродиссекции для анализа протеомного профиля гранул нейромеланина LC-MS/MS
December 16th, 2021
Здесь представлен надежный протокол для выделения гранул нейромеланина из посмертной субстанции nigra pars compacta человека с помощью лазерной микродиссекции. Этот пересмотренный и оптимизированный протокол значительно минимизирует необходимое время для сбора образцов, уменьшает требуемое количество образца и улучшает идентификацию и количественную оценку белков с помощью анализа LC-MS / MS.
Наша комбинация лазерной микродиссекции и масс-спектрометрии позволяет исследовать пространственно разрешенные изменения на протеомном уровне в любом виде ткани. В нашем случае это гранулы нейромеланина. Наш протокол позволяет проводить протеомный анализ на основе ограниченного образца материала.
Что обычно является большой проблемой при работе с посмертной тканью мозга. Поскольку отдельные клетки могут быть выделены для сравнения здоровых и болезненных состояний на протеомном уровне. Это может улучшить наше понимание механизмов заболевания.
Для начала поместите скольжение тканевой мембраны в держатель слайда на робо-сцене с тканью, обращенной вверх. Для получения обзорного сканирования участка ткани. Воспользуйтесь функцией сканирования, выберите интересующую область в левом верхнем и правом нижнем углах.
Затем выберите Сканировать все ROI для выполнения сканирования. Для автоматического отбора гранул нейромеланина в текущем поле зрения. Выберите анализ поля зрения.
Затем выберите инвертировать результат и установите пороговое значение для каналов RGB. Таким образом, только гранулы нейромеланина подсвечиваются красным цветом в окне предварительного просмотра. Теперь нажмите ok, чтобы использовать настроенные настройки для поля зрения.
Отрегулируйте настройки лазера, используя только область слайда, покрытую мембраной. Заполните крышку пробирки для сбора проб 50 микролитрами сверхчистой воды. И вставьте колпачок в коллектор робомотора.
Используя программный интерфейс, расположите робо-движитель над вторым этапом робо, чтобы начать сбор образцов. Запустите лазер. Управляйте настройками энергии и фокусировки во время лазерного процесса и при необходимости регулируйте настройки.
Обеспечьте надлежащую изоляцию и катапультирование изолированных объектов в колпачок пробоотборника по крайней мере для первых 10 объектов. После завершения отбора проб переместите робота в исходное положение и извлеките трубку для сбора проб. После прядения образцов путем центрификации.
Высушите образцы в течение 1,5 часов в вакуумном концентраторе. После выполнения триптического пищеварения, как описано в тексте. Подготовьте образец для анализа ВЭЖХ-МС путем растворения от 200 до 400 нанограммов пептидов образца в определенном объеме 0,1% TFA.
В инертных масс-спектрометрических стеклянных флаконах входные отверстия. Если определение концентрации не применимо из-за низкого количества пробы. Проверьте одинаковую загрузку образца, сравнив общий ионный ток.
Начать анализ протеомных необработанных данных. Нажмите кнопку Загрузить для загрузки необработанных файлов в программное обеспечение. Щелкните Установить эксперимент, чтобы назначить имена образцов.
Определение параметров, специфичных для группы. Добавьте модификации, выбрав деамидацию NQ, окисление M и карбамидометилирование N-term в качестве переменных модификаций. а затем добавить карбамидометилирование С в качестве фиксированной модификации.
Выберите трипсин в качестве фермента пищеварения во вкладке пищеварения. На вкладке Бесплатное количественное определение меток добавьте опцию LFQ и, если необходимо обработать более 10 файлов, выберите опцию быстрого LFQ, чтобы сократить время обработки. Обеспечение того, чтобы все остальные параметры группы оставались в заводских настройках.
Перейдите на вкладку Глобальные параметры и добавьте файл FASTA, производный от uniprot. org на вкладке последовательностей. Измените правило идентификатора соответствующим образом.
И добавьте идентификатор таксономии 9606 для Homo sapiens. Для количественной оценки белка выбирают уникальные и бритвенные пептиды. Затем добавьте опцию iBAQ в качестве меры для количественной оценки белка на вкладке бесплатной количественной оценки метки.
Убедитесь, что все остальные глобальные параметры остаются в заводских настройках, и нажмите кнопку Пуск. После успешного проведения анализа извлеките белковые группы. вывод txt.
Загрузите белковые группы. txt файл в аналитическом программном обеспечении. Добавьте значения iBAQ в качестве основных столбцов и отсортируйте все остальные столбцы в соответствии с их типом.
Отфильтровывайте приманки и загрязняющие вещества, фильтруя строки на основе категориального столбца и фильтруя результаты на основе допустимых значений. Экспортируйте выходные данные в формате txt для дальнейшей обработки. И оцените результаты относительно исследовательского вопроса.
В настоящем исследовании 1 898 белковых групп были идентифицированы в NMG и 1 565 были идентифицированы в окружающей ткани SN, из которых 1 384 были идентифицированы в обеих областях ткани. Таким образом, 514 и 181 белковая группа были идентифицированы исключительно в NMG и SN ткани соответственно. В репрезентативных измерениях DDA.
Несколько более высокие значения iBAQ в NMG по сравнению с SN указывали на более высокое содержание белка цитоплазматического диниена-1, тяжелой цепи 1 в NMG. Это наблюдение может быть проверено в экспериментах PRM для пептида ESPEVLLTLDILK. В котором было обнаружено более высокое изобилие ВНГ.
На основе пиковой области на уровне MS1 и MS2. Наиболее важным шагом на сегодняшний день является изоляция НМГ, поскольку остальная часть протокола основана на том, что этот шаг должен быть выполнен должным образом. После процедуры LMD образцы могут быть использованы и дополнительно обработаны для любого вида омической техники, такой как геномика, транскриптомика, протеомика или липидомика.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Обзор
Это исследование представляет надежный протокол для изоляции гранул нейромеланина из постмортальных тканей субстанции нигры человека с использованием лазерной микродиссекции. Оптимизированный подход значительно сокращает время сбора образцов и необходимое количество, при этом улучшая идентификацию и количественное определение белков с помощью анализа LC-MS/MS.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Протеомика
- Посмортальная анализ тканей мозга
Фон
- Гранулы нейромеланина исторически были сложными для изоляции с целью анализа.
- Традиционные методы требуют больших образцов и продолжительного времени сбора.
- Лазерная микродиссекция позволяет точную изоляцию на уровне отдельной клетки.
- Этот протокол направлен на улучшение понимания механизмов заболеваний при неврологических состояниях.
Цель исследования
- Оптимизировать изоляцию гранул нейромеланина для протеомного анализа.
- Свести к минимуму требования к образцам и сократить время сбора в постмортальных тканях.
- Улучшить выявление белков, связанных с состояниями здоровья и заболеваний.
Используемые методы
- Для изоляции гранул нейромеланина из тканей мозга человека использовалась лазерная микродиссекция.
- Модель включала постмортальные ткани субстанции нигры.
- Был интегрирован детализированный процесс LC-MS/MS для идентификации белков.
- Были подчеркнуты критические шаги, такие как автоматизированный выбор и корректировка настроек лазера.
- Протеомный анализ включал валидацию по отношению к установленным методам количественного определения белков.
Основные результаты
- Были определены 1898 групп белков в гранулах нейромеланина с отличительными характеристиками экспрессии по сравнению с окружающей тканью.
- Примечательные результаты включают более высокие значения iBAQ для определенных белков в гранулах нейромеланина.
- Метод позволяет сравнивать здоровые и болезни на протеомном уровне.
- Это исследование подчеркивает критические выводы касательно состава белков в здоровье и патологии мозга.
Выводы
- Исследование демонстрирует упрощенный подход к изоляции гранул нейромеланина, улучшающий протеомные анализы.
- Оптимизированный метод имеет значительные последствия для понимания механизмов заболеваний при неврологических расстройствах.
- Дальнейшие применения могут привести к прогрессу в клинических и исследовательских условиях, ориентированных на патологии, связанные с нейромеланином.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Laser microdissection enables spatially resolved proteomic analysis of neuromelanin granules from limited post-mortem human brain tissue, addressing a key bottleneck in neurodegenerative disease research. This approach supports target validation and mechanistic de-risking by providing disease-relevant proteomic data from dopaminergic neurons affected in Parkinson's disease. The method enhances predictive confidence in early discovery by allowing direct comparison of healthy and diseased states at the protein level.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating neuromelanin granules for proteomic profiling in Parkinson's disease-relevant tissue.
- Operational Value: Reduces tissue requirements through unbiased, automated collection of granules, facilitating analysis of precious post-mortem samples.
- Scientific Value: Supports biological de-risking by identifying proteins exclusively enriched in neuromelanin granules versus surrounding substantia nigra tissue.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream omics workflows by yielding high-purity granule isolates compatible with LC-MS/MS.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through automated selection thresholds and consistent laser settings for granule isolation.
- Scientific Value: Enables reliable compound evaluation by providing quantitative proteomic outputs (iBAQ, LFQ) from disease-relevant neuronal compartments.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Discusses disease relevance by linking neuromelanin granule proteomics to neurodegenerative conditions like Parkinson's disease and dementia with Lewy bodies.
- Operational Value: Describes continuity from discovery through preclinical validation by enabling proteomic comparison of healthy versus disease conditions.
- Scientific Value: Focuses on predictive de-risking value by identifying differentially abundant proteins (e.g., cytoplasmic dynein-1 heavy chain 1) as potential translational biomarkers.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target validation to preclinical research by providing spatially resolved proteomic data from disease-affected neuronal populations.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling proteomic comparison of neuromelanin granules and surrounding substantia nigra tissue.
- Screening: Describes assay readiness through automated granule selection and reproducible sample collection for downstream LC-MS/MS analysis.
- Analytics: Highlights label-free quantification (LFQ) and iBAQ measurements that allow teams to compare protein abundance between conditions.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity by enabling proteomic profiling of human tissue relevant to Parkinson's disease pathology.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability for omics applications (genomics, transcriptomics, lipidomics) beyond proteomics.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in neurodegeneration research.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability through automated laser microdissection workflows.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in CNS target programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on disease-relevant proteomic signatures.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in laser microdissection operation and mass spectrometry-based proteomics.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs include UV laser microdissection systems and LC-MS/MS platforms.
- Cross-team standardization requirements for granule selection thresholds and sample preparation protocols.
- Adaptation considerations across model systems, including optimization of laser settings for different tissue types.
- Practical limitations include dependency on post-mortem tissue availability and potential protein degradation effects.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:46
Laser Microdissection and Pressure Catapulting
2:46
Sample Preparation for HPLC-MS and Proteomic Raw Data Analysis
5:10
Statistical Analysis
5:50
Results: Protein Identification in Neuromelanin Granules (NMGs) and Substantia nigra (SN)
7:00
Conclusion
