Стандартизация и поддержание 3D-культур печеночных и кишечных органоидов собак для использования в биомедицинских исследованиях
January 31st, 2022
Описаны экспериментальные методы извлечения взрослых стволовых клеток из тканей кишечника и печени собак для создания 3D органоидных культур. Кроме того, обсуждаются лабораторные методы для обеспечения последовательного роста и обеспечения стандартных операционных процедур для сбора, биобанка и возрождения кишечных и печеночных органоидных культур.
Протоколы культивирования собачьих печеночных и кишечных органоидов важны для стандартизации этой новой технологии. Этот метод позволяет надежно и воспроизводимо создавать органоидную культуру собак, включая выделение органоидов, поддержание, сбор и последующее биобанкование образцов. Органоиды собак могут обеспечить отличную модель для многочисленных применений, охватывающих биологию, развитие инфекционных заболеваний, тестирование и открытие лекарств, а также медицину передачи.
Для начала приготовьте пять 15-миллилитров центрифужных трубок с пятью миллилитрами 1X полного хелатирующего раствора, одну трубку с тремя миллилитрами 1X полного хелатирующего раствора, одну пустую трубку и одну трубку с пятью миллилитрами 1X полного хелатирующего раствора и двумя миллилитрами фетальной бычьей сыворотки. В день изоляции поместите в шкаф биобезопасности стерильную чашку Петри, скальпель, ведро со льдом и холодную питательную смесь DMEM F12. Поместите необходимое количество 24-луночной пластины для культивирования клеток в углекислый инкубатор для предварительного нагрева.
Поместите солюбилизированный внеклеточный мембранный матрикс на лед для оттаивания. Предварительно охладите центрифугу до четырех градусов Цельсия. Переместите полную среду с факторами роста из морозильной камеры на водяную баню 37 градусов цельсия, избегая прямого воздействия света.
Встряхните образцы тканей в транспортной трубке в течение 30 секунд. Удалите избыток супернатанта, не отбрасывая какую-либо ткань, путем медленного пипетирования вблизи поверхности жидкости до тех пор, пока в трубке не останется 0,5 миллилитра. Перенесите ткань и оставшийся супернатант в стерильную чашку Петри.
Используя одноразовый скальпель, разрежьте и измельчите ткань на более мелкие кусочки, напоминающие консистенцию пюре, в течение примерно пяти минут. Пипетка измельченной ткани жидкостью из чашки Петри в первую полную пробирку с хелатирующим раствором, затем добавьте два миллилитра усовершенствованной питательной смеси DMEM F12 в чашку Петри. Промыть оставшуюся ткань и перенести в первый полный хелатирующий раствор трубку.
Вихрь 1X полный хелатирующий раствор трубки примерно пять раз в течение пяти секунд. Дайте биопсии осесть на дне трубки в течение одной минуты и удалите супернатант до тех пор, пока не останется пять миллилитров. Перенесите 1X полный хелатирующий раствор из новой трубки в пробирку.
Повторите предыдущий шаг для следующих двух трубок. И на последних двух смывах удалите супернатант до трех миллилитров, оставшихся в трубке. Перенесите биопсию и 1X полный хелатирующий раствор из пробирки в одну лунку из шестилуночной пластины.
Добавьте три миллилитра 1X полного хелатирующего раствора в пробирку. Аккуратно закрутите, чтобы собрать оставшуюся ткань и перенести в тот же колодец пластины. Добавьте 150 микролитров 0,5 молярной тетрауксусной кислоты этилендиамина в лунку и поместите шестилуночную пластину на коромысл 20 градусов 24 об/мин при четырех градусах Цельсия.
Инкубируйте образцы печени в течение 10 минут и образцы кишечника в течение одного часа на движущейся коромысле. Транспортируйте шестилуночную пластину обратно в шкаф биобезопасности и перенесите измельченную ткань и жидкость в трубку, содержащую 1X полный хелатирующий раствор с фетальной бычьей сывороткой. Дайте тканям осесть и транспортировать супернатант с 0,2 миллилитрами верхней части ткани в пустую трубку.
Вращайте трубку, содержащую образец, при 700 XG в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Стволовые клетки теперь гранулируются вместе с измельченной тканью. Осторожно удалите и выбросьте супернатант, чтобы не потревожить гранулу.
Повторное суспендирование гранул в усовершенствованном DMEM F12. Снова раскрутите трубку и аспирируйте супернатант, не нарушая гранулу. Добавьте расчетный объем солюбилизированного внеклеточного мембранного матрикса в пробирку.
Будьте осторожны при удалении среды, чтобы не потерять ячейку гранулы. При добавлении внеклеточного мембранного матрикса пипетка медленно не создает избыточных пузырьков в органоидной суспензии. Держите образец с солюбилизированным внеклеточным мембранным матриксом на льду и засевайте суспензию в середине лунок так, чтобы солюбилизированный внеклеточный мембранный матрикс образовывал куполообразную структуру.
Транспортируйте пластину в инкубатор и дайте солюбилизированному внеклеточному мембранному матриксу затвердеть в течение 30 минут. Смешайте ингибитор ROCK и бета GSK3 в полной среде с факторами роста и добавьте 500 микролитров этого раствора в каждую лунку. Поместите тарелку в инкубатор.
Протокол органоидов собак обычно генерирует приблизительно от 50 000 до 150 000 клеток кишечника или печени на лунку. После выделения стволовых клеток печеночные собачьи органоиды начинают свой жизненный цикл как расширяющиеся сфероиды, а через семь дней превращаются в почковые и дифференцирующие органоиды. Были рассчитаны объем, площадь поверхности, площадь 2D-эллипса и окружность сфероидов.
Площадь и окружность эллипса 2D использовались для оценки здоровья органоидной культуры. Оценка экспрессии маркеров полуколичественным способом показала, что сфероиды преимущественно экспрессировали холангиоцитарный маркер KRT7 в диапазоне от одного до 26%Экспрессия маркера стволовых клеток LGR5 варьировалась от 0,17 до 0,78%, в то время как маркеры гепатоцитов экспрессировались в меньшей степени на 0,05-0,34% для Forkhead box 1A и от 0,03 до 0,28% для цитохрома-P450. 12-минутная инкубация с трипсин-подобной протеазой не ингибировала рост органоидов.
Однако на рост органоидов негативно повлияли с помощью 24-минутной инкубации. Проанализирована живучесть собачьих печеночных органоидов в неблагоприятной среде для определения объема органоидных сред и фундаментного матрикса, необходимого для успешного роста и выживания печеночных органоидов. Выживаемость органоидов варьировалась от 12,9 дней до 18 дней.
Основные методы культивирования клеток и асептические подходы являются необходимыми предпосылками для правильной изоляции и поддержания органоидов.
Обзор
Эта статья описывает экспериментальные методы сбора взрослых стволовых клеток из кишки и печени собак для создания 3D органоидов. Она излагает лабораторные методы для стабильного роста и стандартные процедуры для сбора, хранения в биобазе и возрождения этих органоидов.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Биология стволовых клеток
- Технология органоидов
Бэкграунд
- Органоидные модели собак служат для различных биологических приложений.
- Стандартизация протоколов культивирования органоидов важна для воспроизводимости.
- Техники включают изоляцию, содержание и сбор органоидов.
- Понимание динамики роста органоидов важно для их применения в исследованиях.
Цель исследования
- Создать надежные протоколы для культивирования интестинальных и печеночных органоидов собак.
- Способствовать хранению в биобазе и возрождению образцов органоидов.
- Оценить рост и состояние органоидов в различных условиях.
Используемые методы
- Приготовление хелатирующих растворов и пластинок для культуры клеток.
- Изоляция и измельчение образцов ткани.
- Инкубация образцов с специфическими растворами для стимулирования роста.
- Оценка состояния органоидов через морфологические измерения.
Основные результаты
- Протоколы для собачьих органоидов дают от 50 000 до 150 000 клеток на колодезь.
- Органоидные структуры проявляют различные фазы роста и выражение маркеров.
- Уровень выживаемости органоидов зависит от условий окружающей среды.
- Время инкубации значительно влияет на результаты роста органоидов.
Выводы
- Стандартизированные протоколы повышают надежность культивирования собачьих органоидов.
- Понимание динамики роста важно для успешного применения.
- Будущие исследования могут использовать эти органоиды для тестирования лекарств и моделирования заболеваний.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Standardized 3D canine hepatic and intestinal organoid cultures provide a reproducible, scalable platform for translational drug discovery and toxicology assessment. These organoid systems enable predictive modeling of complex disease biology, supporting mechanistic de-risking and target validation in large animal models relevant to human medicine. Biobanking and maintenance protocols further enhance portfolio continuity and reduce reliance on continuous tissue harvesting.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of therapeutic hypotheses in disease-relevant canine models.
- Supports mechanistic de-risking by modeling multifactorial disease pathways in vitro.
- Facilitates functional target validation through quantitative marker expression and morphological assessment.
- Provides a platform for predictive confidence in early-stage portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, reproducible organoid cultures for downstream compound screening.
- Enables quantitative assessment of organoid health via 2D ellipse area and circumference measurements.
- Supports assay scalability and platform reuse through biobanking and indefinite sub-culturing.
- Improves reliability of drug permeability and toxicology testing in a controlled system.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker strategies by modeling canine diseases analogous to human conditions.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation using biobanked organoid lines.
- Reduces biological risk by providing a robust, disease-relevant preclinical model.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on organoid viability and marker expression data.
Pipeline & Workflow Integration
These protocols position canine organoid cultures as a bridge from early discovery through lead identification and preclinical research, supporting hypothesis testing and mechanistic studies in a scalable, reusable format.
- Discovery Biology: Facilitates pathway clarification and biological de-risking via marker expression and morphological metrics.
- Screening: Provides assay-ready, reproducible organoid systems for compound evaluation and toxicology assessment.
- Analytics: Enables quantitative readouts such as cell yield, viability, and marker expression for condition comparison.
- Translational Research: Supports preclinical continuity and biomarker alignment in disease-relevant canine models.
- Enterprise Reuse: Biobanking protocols allow for long-term storage and repeated use across multiple R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes workflows, enhances reproducibility, and supports scalable culture expansion.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of candidates using robust, reproducible data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture and aseptic technique for reliable organoid isolation and maintenance.
- Demands access to specialized instrumentation, including biosafety cabinets, incubators, and imaging systems.
- Necessitates cross-team standardization of protocols for reproducibility and data comparability.
- Adaptation may be needed for different tissue sources or disease models within the canine system.
- Limitations include sensitivity to incubation times and environmental conditions affecting organoid viability.
