Трансплантация индуцированной человеком плюрипотентной микроглии, полученной из стволовых клеток, в мозг иммунокомпетентных мышей неинвазивным трансназальным путем
31 мая 2022 г.
Протокол, представленный здесь, позволяет трансплантировать индуцированную плюрипотентную микроглию человека, полученную из стволовых клеток (iPSMG), в мозг трансназальным путем у иммунокомпетентных мышей. Показан способ получения и трансназальной трансплантации клеток и введения цитокиновой смеси для поддержания иПСМГ.
Этот протокол позволяет проводить неинвазивную трансплантацию iPSMG в иммунокомпетентный мозг мыши путем сочетания фармакологического включения/выключения антагониста рецептора CSF1 PLX5622 с трансназальной трансплантацией. Основным преимуществом этой методики является то, что iPSMG можно пересаживать, не вызывая повреждения головного мозга даже у иммунокомпетентных мышей. Трансплантация микроглии может служить потенциальной терапией для обмена дисфункциональными микроглиями с функциональными при различных нейродегенеративных заболеваниях в будущем.
Продемонстрировать процедуру будет Биджай Параджули, исследователь из моей лаборатории. Начните с быстрого размораживания замороженных индуцированных плюрипотентных клеток микроглии человека, полученных из стволовых клеток, на водяной бане с температурой 37 градусов цельсия. Вращайте образцы до тех пор, пока весь видимый лед не растает.
Добавьте размороженный iPSMG в культуральную среду, прогретую до 37 градусов цельсия. Добавьте один миллилитр клеток к 10 миллилитрам культуральной среды. Центрифугируйте клетки в 300 раз г в течение пяти минут для получения ячейки гранулы.
Удалите супернатант, не нарушая гранулу клетки. Добавьте трансплантационную среду для получения клеточной концентрации от 10 до пятой клетки на микролитр. Поместите iPSMG на лед, и сразу же приступайте к пересадке.
Чтобы подготовить мышей к трансназальной трансплантации, кормите самцов мышей диетой, содержащей PLX, в течение семи дней. В конце седьмого дня прекратите диету PLX и кормите мышей нормальным рационом. За час до трансназальной трансплантации iPSMG вводят 2,5 микролитра гиалуронидазы в PBS в каждую ноздрю дважды, используя 10-микролитровый наконечник пипетки для увеличения проницаемости слизистой оболочки носа.
Поместите мышей в положение лежа на спине после применения гиалуронидазы. Вводят 2,5 микролитра гиалуронидазы за десять минут до трансназальной трансплантации iPSMG. Нанесите 2,5 микролитра клеточной суспензии в одну ноздрю мыши с помощью 10-микролитрового наконечника пипетки.
Поместите мышь в положение лежа на спине в течение пяти минут перед введением клеточной суспензии в другую ноздрю. Вводят клеточную суспензию четыре раза, применяя общий объем 20 микролитров на животное. Через 48 часов после прекращения кормления PLX повторяют введение гиалуронидазы и клеточной суспензии тем же мышам.
Для введения цитокинов нанесите 2,5 микролитра трансплантационной среды в одну ноздрю мыши с помощью 10-микролитрового наконечника пипетки. После двух месяцев трансназальной трансплантации количество трансплантированных клеток может быть определено путем подсчета клеток, которые являются положительными как для специфических для человека, так и для панмикроглиальных маркеров. Эндогенная микроглия мыши положительна только для панмикроглиального маркера.
У контрольных мышей была обнаружена только мышиная микроглия как в коре, так и в гиппокампе. В коре трансплантированных мышей iPSMG были обнаружены только мышиные микроглии, тогда как в гиппокампе были обнаружены iPSMG. При попытке этого протокола полное удаление супернатанта имеет важное значение для предотвращения разбавления цитокинов.
Крайне важно применять цитокин каждые 12 часов для жизнеспособности трансплантированных клеток. Истощение эндогенной мышиной микроглии требуется для трансплантации iPSMG. Эта процедура позволяет трансплантировать iPSMG в нормальный или больной мозг мыши.
Таким образом, можно определить характеристику iPSMG, а также реакцию на заболевание. Этот метод подходит для определения in vivo характеристики iPSMG в мозге мыши. Таким образом, трансплантация iPSMG мышам модели заболевания поможет нам понять ответ и может проложить путь к новой терапевтической цели.
Обзор
В данном исследовании представлен неинвазивный метод трансплантации микроглии человека, полученной из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSMG), в головной мозг иммунокомпетентных мышей трансназальным путем. Протокол основан на введении цитокинов и делеции эндогенной микроглии для обеспечения эффективной интеграции iPSMG, что потенциально открывает путь к разработке терапевтических подходов при нейродегенеративных заболеваниях.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Исследования стволовых клеток
- Биология микроглии
Теоретическая часть
- Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в функциональную микроглию.
- Дисфункция микроглии играет роль в развитии различных нейродегенеративных заболеваний.
- Трансназальное введение представляет собой новый подход к трансплантации клеток.
- Введение цитокинов имеет решающее значение для жизнеспособности клеток после трансплантации.
Цель исследования
- Разработать метод неинвазивной трансплантации микроглии.
- Оценить возможность использования трансназального введения для сохранения нормального функционирования мозга.
- Оценить потенциал iPSMG в замещении дисфункциональной микроглии.
Используемые методы
- Основная платформа предполагает трансназальную трансплантацию iPSMG иммунокомпетентным мышам.
- Самцам мышей предварительно вводили антагонист рецептора CSF1 PLX5622 и раствор гиалуронидазы для повышения проницаемости слизистой оболочки носа.
- Клеточные суспензии вводили многократно в соответствии с установленным графиком для обеспечения надлежащей интеграции.
- Посттрансплантационный мониторинг включал оценку наличия и жизнеспособности трансплантированных клеток.
Основные результаты
- Трансплантированные iPSMG успешно интегрировались в гиппокамп мыши, не повреждая эндогенную микроглию.
- Введение цитокинов каждые 12 часов имело решающее значение для поддержания жизнеспособности клеток после трансплантации.
- Данный метод позволяет изучать ответы iPSMG как в нормальных моделях, так и в моделях заболеваний.
Выводы
- Данный протокол облегчает изучение iPSMG in vivo, что может послужить основой для разработки будущих методов генной терапии нейродегенеративных заболеваний.
- Понимание поведения трансплантированной микроглии может помочь определить ее роль в поддержании здоровья мозга.
- Этот подход может открыть пути к поиску новых терапевтических мишеней для лечения патологий, связанных с микроглией.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Неинвазивная трансплантация микроглии, полученной из иПСК человека, в мозг иммунокомпетентных мышей позволяет напрямую изучать функции человеческой микроглии и её реакцию на заболевания in vivo. Данный подход устраняет трансляционные разрывы между микроглией грызунов и человека, способствуя созданию более прогностических доклинических моделей для исследования нейродегенеративных заболеваний. Протокол улучшает валидацию мишеней и снижение механистических рисков на ранних этапах поиска и в критические точки доклинических исследований.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Позволяет исследовать биологию микроглии человека in vivo в среде мозга млекопитающего.
- Способствует снижению механистических рисков за счет разграничения специфических для человека ответов микроглии и ответов в мышиных моделях.
- Облегчает функциональную валидацию мишеней для путей нейровоспаления и нейродегенерации.
Скрининг и разработка анализа
- Предлагает валидированную систему для оценки интеграции и жизнеспособности микроглии человека in vivo.
- Обеспечивает воспроизводимый количественный анализ трансплантированной и эндогенной микроглии с использованием специфических маркеров.
- Позволяет проводить последующий скрининг соединений, воздействующих на функции микроглии человека в физиологическом контексте.
Трансляционные и доклинические исследования
- Приводит доклинические модели в соответствие с клинической значимостью заболеваний человека путем интеграции микроглии человека в мозг мышей.
- Позволяет оценивать ответ микроглии человека как у здоровых мышей, так и у мышей с моделью заболевания.
- Повышает прогностическую достоверность при поиске трансляционных биомаркеров и проверке терапевтических гипотез.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный протокол связывает этап раннего поиска и доклинические исследования, обеспечивая возможность функционального изучения микроглии человека in vivo, что способствует идентификации перспективных соединений и обеспечению трансляционной преемственности.
- Фундаментальная биология: Обеспечивает проверку гипотез о роли микроглии человека в физиологии и патологии головного мозга.
- Скрининг: Позволяет количественно оценить интеграцию и жизнеспособность клеток после трансплантации.
- Аналитика: Обеспечивает дифференциацию микроглии человека и мыши на основе маркерного анализа для достоверной обработки данных.
- Трансляционные исследования: Способствует моделированию релевантных заболеваний путем трансплантации iPSMG мышам с моделями заболеваний.
- Повторное использование в масштабах предприятия: Создает воспроизводимую платформу для оценки функций микроглии человека в контексте различных заболеваний.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает прогностическую достоверность и снижает видоспецифическую неопределенность в исследованиях нейровоспаления.
- Операционная ценность: Стандартизирует рабочие процессы неинвазивной доставки и количественного анализа клеток для обеспечения воспроизводимости результатов в различных исследованиях.
- Стратегическая ценность: Позволяет более эффективно принимать решения о целесообразности дальнейшей разработки терапевтических средств, нацеленных на микроглию, за счет предоставления данных, релевантных для человека.
- Влияние на портфель: Способствует приоритизации программ по лечению нейродегенеративных заболеваний с учетом рисков за счет повышения точности моделей.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с культурами iPSC, дифференцировкой микроглии и методами трансплантации in vivo.
- Необходим доступ к фармакологическим агентам для делеции эндогенной микроглии и цитокиновой поддержке.
- Требуются стандартизированные протоколы подготовки клеток, трансплантации и посттрансплантационного анализа.
- Адаптация к другим модельным системам может потребовать оптимизации параметров доставки и делеции.
- Согласно протоколу, непрерывное введение цитокинов имеет критическое значение для жизнеспособности трансплантированных клеток.
