Трансплантация индуцированной человеком плюрипотентной микроглии, полученной из стволовых клеток, в мозг иммунокомпетентных мышей неинвазивным трансназальным путем
31 мая 2022 г.
Протокол, представленный здесь, позволяет трансплантировать индуцированную плюрипотентную микроглию человека, полученную из стволовых клеток (iPSMG), в мозг трансназальным путем у иммунокомпетентных мышей. Показан способ получения и трансназальной трансплантации клеток и введения цитокиновой смеси для поддержания иПСМГ.
Этот протокол позволяет проводить неинвазивную трансплантацию iPSMG в иммунокомпетентный мозг мыши путем сочетания фармакологического включения/выключения антагониста рецептора CSF1 PLX5622 с трансназальной трансплантацией. Основным преимуществом этой методики является то, что iPSMG можно пересаживать, не вызывая повреждения головного мозга даже у иммунокомпетентных мышей. Трансплантация микроглии может служить потенциальной терапией для обмена дисфункциональными микроглиями с функциональными при различных нейродегенеративных заболеваниях в будущем.
Продемонстрировать процедуру будет Биджай Параджули, исследователь из моей лаборатории. Начните с быстрого размораживания замороженных индуцированных плюрипотентных клеток микроглии человека, полученных из стволовых клеток, на водяной бане с температурой 37 градусов цельсия. Вращайте образцы до тех пор, пока весь видимый лед не растает.
Добавьте размороженный iPSMG в культуральную среду, прогретую до 37 градусов цельсия. Добавьте один миллилитр клеток к 10 миллилитрам культуральной среды. Центрифугируйте клетки в 300 раз г в течение пяти минут для получения ячейки гранулы.
Удалите супернатант, не нарушая гранулу клетки. Добавьте трансплантационную среду для получения клеточной концентрации от 10 до пятой клетки на микролитр. Поместите iPSMG на лед, и сразу же приступайте к пересадке.
Чтобы подготовить мышей к трансназальной трансплантации, кормите самцов мышей диетой, содержащей PLX, в течение семи дней. В конце седьмого дня прекратите диету PLX и кормите мышей нормальным рационом. За час до трансназальной трансплантации iPSMG вводят 2,5 микролитра гиалуронидазы в PBS в каждую ноздрю дважды, используя 10-микролитровый наконечник пипетки для увеличения проницаемости слизистой оболочки носа.
Поместите мышей в положение лежа на спине после применения гиалуронидазы. Вводят 2,5 микролитра гиалуронидазы за десять минут до трансназальной трансплантации iPSMG. Нанесите 2,5 микролитра клеточной суспензии в одну ноздрю мыши с помощью 10-микролитрового наконечника пипетки.
Поместите мышь в положение лежа на спине в течение пяти минут перед введением клеточной суспензии в другую ноздрю. Вводят клеточную суспензию четыре раза, применяя общий объем 20 микролитров на животное. Через 48 часов после прекращения кормления PLX повторяют введение гиалуронидазы и клеточной суспензии тем же мышам.
Для введения цитокинов нанесите 2,5 микролитра трансплантационной среды в одну ноздрю мыши с помощью 10-микролитрового наконечника пипетки. После двух месяцев трансназальной трансплантации количество трансплантированных клеток может быть определено путем подсчета клеток, которые являются положительными как для специфических для человека, так и для панмикроглиальных маркеров. Эндогенная микроглия мыши положительна только для панмикроглиального маркера.
У контрольных мышей была обнаружена только мышиная микроглия как в коре, так и в гиппокампе. В коре трансплантированных мышей iPSMG были обнаружены только мышиные микроглии, тогда как в гиппокампе были обнаружены iPSMG. При попытке этого протокола полное удаление супернатанта имеет важное значение для предотвращения разбавления цитокинов.
Крайне важно применять цитокин каждые 12 часов для жизнеспособности трансплантированных клеток. Истощение эндогенной мышиной микроглии требуется для трансплантации iPSMG. Эта процедура позволяет трансплантировать iPSMG в нормальный или больной мозг мыши.
Таким образом, можно определить характеристику iPSMG, а также реакцию на заболевание. Этот метод подходит для определения in vivo характеристики iPSMG в мозге мыши. Таким образом, трансплантация iPSMG мышам модели заболевания поможет нам понять ответ и может проложить путь к новой терапевтической цели.
Обзор
Это исследование представляет неинвазивный метод трансплантации индукированных плюрипотентных стволовых клеток, полученных из человеческих микроглии (iPSMG), в мозг иммунокомпетентных мышей трансназальным путем. Протокол использует введение цитокинов и удаление эндогенной микроглии для обеспечения эффективной интеграции iPSMG, что может проложить путь для терапевтических подходов при нейродегенеративных заболеваниях.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Исследование стволовых клеток
- Биология микроглии
Фон
- Индукированные плюрипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в функциональную микроглию.
- Дисфункция микроглии связана с различными нейродегенеративными заболеваниями.
- Трансназальная доставка представляет новый подход к трансплантации клеток.
- Введение цитокинов важно для жизнеспособности клеток после трансплантации.
Цель исследования
- Разработать метод неинвазивной трансплантации микроглии.
- Оценить возможность трансназальной доставки для поддержания нормальной функции мозга.
- Оценить потенциал iPSMG в замене дисфункциональной микроглии.
Используемые методы
- Основной платформой является трансназальная трансплантация iPSMG у иммунокомпетентных мышей.
- Самцы мышей предварительно лечились антагонисто рецептора CSF1 PLX5622 и раствором гиалуронидазы для повышения проницаемости носа.
- Суспензии клеток вводили в несколько доз по определенным временным рамкам для обеспечения правильной интеграции.
- Мониторинг после трансплантации включал оценку наличия и жизнеспособности трансплантированных клеток.
Основные результаты
- Трансплантированные iPSMG успешно интегрировались в гиппокамп мыши без повреждения эндогенной микроглии.
- Введение цитокинов каждые 12 часов было критически важно для поддержания жизнеспособности клеток после трансплантации.
- Этот метод позволяет исследовать реакции iPSMG как в нормальных, так и в патологических моделях.
Выводы
- Этот протокол облегчает исследование iPSMG in vivo, что может помочь в разработке будущих геномных терапий для нейродегенеративных заболеваний.
- Понимание поведения трансплантированной микроглии может помочь определить их роль в здоровье мозга.
- Этот подход может открыть пути к новым терапевтическим целям в лечении патологий, связанных с микроглией.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Non-invasive transplantation of human iPSC-derived microglia into immunocompetent mouse brains enables direct in vivo study of human microglial function and disease response. This approach addresses translational gaps between rodent and human microglia, supporting more predictive preclinical models for neurodegenerative disease research. The protocol enhances target validation and mechanistic de-risking at early discovery and preclinical inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables in vivo interrogation of human microglial biology within a mammalian brain environment.
- Supports mechanistic de-risking by distinguishing human-specific microglial responses from murine models.
- Facilitates functional target validation for neuroinflammation and neurodegeneration pathways.
Screening & Assay Development
- Provides a validated system for evaluating human microglial integration and viability in vivo.
- Enables reproducible quantification of transplanted versus endogenous microglia using specific markers.
- Supports downstream screening of compounds targeting human microglial function in a physiological context.
Translational & Preclinical Research
- Aligns preclinical models with human disease relevance by incorporating human microglia into mouse brains.
- Enables assessment of human microglial response in both normal and disease model mice.
- Improves predictive confidence for translational biomarker discovery and therapeutic hypothesis testing.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol bridges early discovery and preclinical research by enabling functional studies of human microglia in vivo, supporting lead identification and translational continuity.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on human microglial roles in brain physiology and pathology.
- Screening: Delivers quantitative readouts of cell integration and viability post-transplantation.
- Analytics: Enables marker-based discrimination between human and mouse microglia for robust data analysis.
- Translational Research: Facilitates disease-relevant modeling by transplanting iPSMG into disease model mice.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for evaluating human microglial function across multiple disease contexts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces species-specific ambiguity in neuroinflammation research.
- Operational Value: Standardizes non-invasive cell delivery and quantification workflows for cross-study reproducibility.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions for microglia-targeted therapeutics by providing human-relevant data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of neurodegenerative disease programs by improving model fidelity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in iPSC culture, microglial differentiation, and in vivo transplantation techniques.
- Needs access to pharmacological agents for endogenous microglia depletion and cytokine support.
- Demands standardized protocols for cell preparation, transplantation, and post-transplant analysis.
- Adaptation to other model systems may require optimization of delivery and depletion parameters.
- Continuous cytokine administration is critical for transplanted cell viability, as supported by the protocol.
