Количественная оценка динамики цитоскелетов с помощью дифференциальной динамической микроскопии

Наш протокол может количественно оценивать динамику во многих системах, используя ряд методов оптической микроскопии. Мы выделяем, как этот метод может, в частности, помочь охарактеризовать динамику восстановленных сетей цитоскелетов. Основным преимуществом использования нашего программного пакета для дифференциальной динамической микроскопии является то, что он хорошо документирован, имеет несколько файлов анализа примеров и может быть легко адаптирован для изучения различных типов динамики.

Наш программный пакет может быть использован для количественной оценки динамики не только в восстановленных цитоскелетных сетях, но и в других мягких и биологически значимых материалах. На основе шкал времени и длины зонд получает последовательности изображений более 1000 кадров с помощью программного обеспечения для управления микроскопом, такого как Micro-Manager. В папке примеров, предоставленной в репозитории кода PyDDM, создайте копию файла параметров с именем example_parameter_file.yml.

Откройте этот EML-файл с помощью текстового редактора, такого как Блокнот +, или текстового редактора в JupyterLab. В скопированном EML-файле укажите каталог данных и имя файла, соответствующие последовательности изображений, подлежащих анализу. В разделе метаданных укажите размер пикселя и частоту кадров.

В разделе параметров анализа выберите параметры для расчета матрицы DDM, такие как количество различных времен задержки и самое длительное время задержки. Предоставьте подробную информацию о подгонке матрицы DDM или промежуточной функции рассеяния в разделе параметров подгонки, такую как имя модели и параметр модели, начальное предположение, нижняя граница и верхняя граница. Инициализируйте экземпляр класса анализа DDM, предоставив метаданные в параметрах анализа, передав имя файла EML с полным путем к файлу DDM-анализу.

Кроме того, можно передать метаданные и параметры в виде структуры данных словаря Python. Запустите функцию для вычисления матрицы DDM. Проверьте возвращенные данные с помощью связанных переменных и метаданных, которые хранятся в виде набора данных в пакете Xarray.

Затем осмотрите графики и рисунки, которые сохраняются в виде PDF-файла и каталога данных. На одном из этих графиков показан метод оценки фона по умолчанию. При необходимости измените метод, в котором оценивается фон, используя метод параметра background в EML-файле или в качестве необязательного аргумента ключевого слова для матрицы DDM функции calculate.

Инициализируйте экземпляр класса DDM fit, передав имя EML-файла, содержащего метаданные изображения и параметры подгонки. Перечислите доступные модели, выполнив функцию печати моделей подгонки. Укажите модель, которая будет использоваться в файле параметров EML или с помощью функции перезагрузить модель соответствия по имени.

Для каждого параметра в выбранной модели задайте начальные угадывания и границы, если они отличаются от значений, указанных в EML-файле, с помощью функций задайте начальное угадывание параметра и установите границы параметров. Выполните подгонку с помощью функции fit. Генерация графиков для проверки соответствия в зависимости q от параметров соответствия с помощью отчета о подгонке функции.

Проверьте выходные данные, включая рисунок с двумя на два подсюжета, показывающих матрицу DDM или ISF при четырех значениях q вместе с подгонкой. Используйте обзор классов DDM в среде Jupyter Notebook для построения матрицы DDM или ISF вместе с наиболее подходящим интерактивным способом. Нажатие на точку на графике времени распада по отношению к волновому числу покажет данные и соответствие.

Проверьте результаты подгонки, сохраненные в наборе данных Xarray, и используйте функцию два netCDF или встроенный модуль Python для сохранения этой структуры данных на диск. DDM-анализ проводили на серии изображений яркого поля из 0,6-микронных шариков в виментиновой сети и изображениях конфокального микроскопа из активной композитной сети актин-микротрубочек со спектрально отчетливыми флуоресцентными метками. Промежуточные функции рассеяния были построены как функция времени задержки при различных волновых числах и сети с концентрацией виментина 19 микромоляров и 34 микромолярия.

Длительное временное плато задержки функции при значении значительно выше нуля указывает на неэргодичность. Время распада тау, построенное как функция q для двух сетей с различными концентрациями виментина, показывает субдиффузное или замкнутое движение. Параметры неэргодичности c, построенные как функция q в квадрате для сети с 34 и 49 микромолярным виментином, показали, что логарифм c был пропорционален q в квадрате, как и ожидалось для ограниченного движения.

Графики среднего квадратного смещения и времени задержки показали, что значения, определенные на основе ДДМ, хорошо согласуются со значениями, полученными с помощью отслеживания отдельных частиц. Для более концентрированной сети значение плато в более длительное время задержки. Матрица DDM в сравнении со временем задержки для активной композитной сети актин-микротрубочки показала, что матрица DDM для конкретного значения q имела плато при низком времени задержки, а затем увеличивалась в дальнейшем плато в большие промежутки времени задержки.

Характерное время распада тау от прилегания к матрице DDM показывает, что связь между тау и q указывает на баллистическое движение. После разработки этого программного пакета PyDDM мы использовали его для исследования анизотропной и изменяющейся во времени динамики активных сетей цитоскелетов и других систем.